辣根过氧化物酶

辣根过氧化物酶临床检验试剂中的常用酶01简介制备目录02基本信息辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase,HRP），是临床检验试剂中的常用酶。该产品不但广泛用于多个生化检测项目，也广泛运用于免疫类（ELISA）试剂盒。过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分，对试剂盒的质量有重要影响。简介用途该酶催化简介该酶催化Donor+H2O2--→Oxidizeddonor+2H2O。辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase,HRP）

比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多个同工酶组成，分子量为40,000，等电点为pH3～9，酶催化的最适pH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。酶溶于水和58%以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm/OD275nm的比值RZ（德文ReinheitZahl）表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右（最高可达3.4）。RZ值越小，非酶蛋白就越多。用途（1）RZ＞3活性＞250u/mg，主要应用于免疫学，是高纯度的过氧化酶。采用特殊色谱纯化技术以除去会影响免疫学反应的同工酶B.（2）RZ＞2活性＞180u/mg，主要应用于临床化学，我们的客户也有将这个规格的产品应用于免疫学研究的。此时，一个标准化的分析方法就变得尤为重要。（3）RZ＞1活性＞100u/mg，主要应用于血糖试纸和尿液分析试纸。（4）RZ＞0.6活性＞60u/mg，主要应用于尿液分析试纸。制备实验原理操作步骤仪器和试剂制备实验原理过氧化物酶催化以下反应：2H2O2→O2+2H2O这一类酶以铁卟啉为辅基，所以属血红素蛋白质类（hemeProteins）。过氧化物酶在生物界分布极广，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要的作用。本实验是以辣根为原料，经过水的抽提，硫酸铵和丙酮分级分离，再经锌离子纯化，透析除盐，冷冻干燥，最后制得高纯度的辣根过氧化物酶。辣根过氧化物酶分子量在40,000左右，是一种含亚铁血红素的蛋白质，等电点7.2；易溶于水，溶解度为5%（W/V），溶液呈棕红色，透明；也溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液，而0.62饱和度以上则不溶。该酶最适pH为7.0（对愈创木酚为氢给体而言）。在室温下HRP在几周内保持稳定，加热到63℃后15分钟内稳定。辣根过氧化物酶氧化还原电势很低，pH6.08时，E’0=-0.2070V；pH为7.71时，E’0=-0.5787V。仪器和试剂仪器离心机、干燥器、分光光度计。试剂⒈硫酸铵：工业纯和化学纯；⒉丙酮。⒊10mMpH7.0磷酸盐缓冲液：称取243.5毫克磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）和857毫克磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O），溶于400毫升水中。⒋20mM愈创木酚溶液：取0.22毫升愈创木酚加水至100毫升。⒌40mM过氧化氢溶液：取0.4毫升30%过氧化氢加水至100毫升（如测k1则用10mM过氧化氢溶液）。临用前配制。⒍5%乙酸钡溶液⒎奈氏试剂操作步骤（一）HRP的制备⒈水提取：称取10斤用水冲刷干净的鲜辣根（辣根皮中亦含有丰富的HRP），用菜刀切成小碎块，在搅肉机中搅碎1~2次。碎渣浆用1倍体积的水在低温下搅拌提取过夜（亦可采用高速抽提法）。次日用甩干机（或离心机）甩干，收集滤液，碎渣再用1/4倍体积水浸泡提取一次，合并两次滤液，量总体积和度，0。⒉硫酸铵分级分离：在不断搅拌下，每升滤液中慢慢加入226克硫酸铵粉末（相当于0.40饱和度），大约在1~2小时内加完，置冷室中放置过夜。次日将上清液小心地用虹吸管移出，下面浑浊液以3000转/分离心15分钟，弃沉淀，合并上清液。再按每升上清液加258克硫酸铵粉末（0.8饱和度）随加随搅拌，当硫酸铵全部溶解后，置冷室过夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰冻离心机中以转/分离心20分钟，弃去上清液，收集沉淀。将沉淀悬浮于100~150毫升蒸馏水中（加水量要使沉淀全部溶解为止），分装于透析袋内，放在流动自来水中进行透析1~2天，直到硫酸铵透析完毕为止（可用5%乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检查）。然