蛋白质分子折叠机理

蛋白质分子折叠机理第一页，共二十六页，编辑于2023年，星期五主要原因：对于研究生物大分子结构与功能的关系有重要的学术价值。由于蛋白质工程研究的需要基因工程研究发展的需要先进实验设备的应用，研究手段的提高。

(1)、二维核磁共振技术的建立，分辨率高的核磁共振仪的改进和完善。

(2)、DNA重组技术的应用为蛋白质折叠的研究提供丰富的研究对象。

(3)、计算机的进步和应用第二页，共二十六页，编辑于2023年，星期五第二节、蛋白质的变性与复性一、蛋白质变性的基本概念：1。引起蛋白质变性的因素：物理因素、化学因素2。蛋白质变性表现：物理性质的改变：化学性质的改变：生物学性质的改变：变性作用：天然蛋白质：变性蛋白质：蛋白质变性：可逆变性：不可逆变性：第三页，共二十六页，编辑于2023年，星期五3。检测蛋白质变性的方法：测定蛋白质的比活力以天然蛋白质为对照，测定蛋白质的物理性质的变化例如：旋光法旋光度圆二色性法椭圆度紫外差示光谱消光系数粘度法特性粘度电泳法电泳迁移率蛋白质化学性质的变化：例如：侧链基团的反应性被蛋白酶水解情况蛋白质的抗原性蛋白质的溶解度第四页，共二十六页，编辑于2023年，星期五4。蛋白质变性研究简史第一阶段：变性现象的观察，吴宪1931年变性理论为代表第二阶段：变性与蛋白质分子构象的关系第三阶段：分子构象的变化研究－X光晶体衍射二、各种变性因素对蛋白质构象的影响1。温度：热变性、可逆与不可逆2。pH：3。有机溶剂：静电力、氢键、疏水键静电力：改变溶液的介电常数、影响离子氛、影响蛋白质分子和溶剂间的相互作用第五页，共二十六页，编辑于2023年，星期五氢键：能与蛋白质生成强氢键的溶剂，不利于蛋白质分子内部的氢键形成，而不能与蛋白质生成强氢键的溶剂，有利于蛋白质分子内部的氢键形成。疏水键：疏水键是一种疏水侧链为了避开水相而群集在一起的一种相互作用力。有机溶剂可以降低溶液的极性，破坏蛋白质分子中的疏水键，导致蛋白质构象的变化。4。脲、胍等变性剂对蛋白质构象的影响：5。表面变性剂对蛋白质构象的影响：长链的脂肪酸、SDS第六页，共二十六页，编辑于2023年，星期五三、蛋白质变性后构象的变化：吴宪1931年提出的变性理论：蛋白质变性后，肽链由原来紧密有序的构象变成松散无规的构象。1968年Tantord把变性产物的构象概括：高浓度的脲、胍变性的蛋白质，呈无规卷曲的构象，若打开二硫键，变成线状无规卷曲热、酸碱变性的蛋白质，往往保持部分紧密构象。高浓度有机溶剂变性蛋白质的螺旋度增大，不存在疏水区第七页，共二十六页，编辑于2023年，星期五四、复性：Renaturation概念：变性的蛋白质在除去变性因素后，恢复到天然状态的构象和生物活性的过程称为蛋白质的复性作用。第三节：蛋白质的折叠：Folding蛋白质折叠：探讨蛋白质由伸展态(变性)经折叠或再折叠(复性)成天然态的机理。探讨蛋白质一级结构与高级结构的关系：杜雨苍：1961年、胰岛素A、B链的拆开、再合并，二硫键形成。体外化学合成胰岛素A、B链，研究二硫键形成的情况第八页，共二十六页，编辑于2023年，星期五Anfinsen1961年：核糖核酸酶变性与复性的情况－4对二硫键被还原后再氧化重组，可以折叠到天然状态，恢复生物功能。一级结构与高级结构的关系：形成高级结构的信息全部蕴藏于一级结构之中。一级结构含有全部高级结构的折叠密码。1979年：Privalov提出蛋白质折叠的“二态模型”

U(伸展态)N(天然态)1989年Kuwajima认为蛋白质折叠是逐步发生的过程，但未捕捉到中间态。1992年Dobson首次报道蛋白质折叠的中间态，提出“三态”模型第九页，共二十六页，编辑于2023年，星期五第四节、蛋白质体外折叠机理：1。折叠步骤：三态模型：认为蛋白质肽链从伸展态(U)经过早期的变化进入中间态(I)，然后再由中间态过渡到最终的天然态。2。折叠过程的起始点：蛋白质氨基酸侧链的形状、大小的不同将影响到侧链在三维结构中所在的位置和安排方式；侧链的极性的不同决定蛋白质分子中氨基酸残基之间和蛋白质与水之间的相互作用的性质和强度。第十页，共二十六页，编辑于2023年，星期五折叠起始点：折叠起始于稳定二级结构的形成：变性后部分残余的蛋白质二级结构如某些扭曲、转角作为折叠的“种子”，氨基酸肽链围绕它们形成较稳定的紧密的区域，再进一步形成稳定的二级结构。折叠由疏水倒塌(hydrophobiccollapse)开始：由于氨基酸侧链基团的疏水作用引起链的倒塌，使得疏水侧链集中藏于分子内部，极性侧链露于表面与水接触。折叠起始于共价键相互作用的形成：1988年Oas&Kim(Nature336,42):牛胰胰蛋白酶抑制剂；合成；肽链片断；P(16肽，No.43-58,-螺旋),P(14肽No.20-33,-折叠)；圆二色性测定肽链的构象完全伸展(还原态)；当30位和51位的二硫键连接后，两条肽链形成稳定的二级结构第十一页，共二十六页，编辑于2023年，星期五3。折叠中间态：Ptitsyn研究牛的-乳清蛋白在热变性、胍变性时，蛋白质的物理性质的变化时，发现存在着一种相对稳定的具有三级结构的紧密球状物的中间态，称为熔球态(melton-globulestate)。熔球态的特征：具有天然态的一级结构在分子中二级结构含量较高。三级结构不完整。熔球态热变性时没有温度跃迁、紫外吸收变化不明显。第十二页，共二十六页，编辑于2023年，星期五4．折叠途径：Foldingpathway伸展的肽链在折叠成天然态的过程中，要尝试所有可能的构象，直到形成其天然态蛋白质的构象为止。？？蛋白质折叠沿着单一的限定的途径进行，每个分子都按着同样的限定顺序进入天然态。？？蛋白质折叠沿着有限的多途径进行，同一种蛋白质的不同分子在折叠过程中可以沿着不同途径达到同样的天然态，形成天然态途径的选择是有限的。第十三页，共二十六页，编辑于2023年，星期五总结：体外蛋白质的折叠可能是：或者始于疏水倒塌、或者始于稳定二级结构的形成、或者始于共价键的相互作用如二硫键的形成。在折叠早期阶段，可能这三种方式联合起作用，接着折叠反应可能沿着有限的途径形成中间态(如熔球态)。中间态的结构紧密、二级结构含量较高，但缺乏明显的三级结构。最后由中间态进入天然态，此步是蛋白质折叠的限速步骤。第十四页，共二十六页，编辑于2023年，星期五第五节、伴侣蛋白与肽链折叠：1．伴侣蛋白及其功能：伴侣蛋白(chaperones)分子伴侣(molecularchaperones):辅助蛋白质多肽链在合成过程中的正确折叠和寡聚蛋白的组装。伴侣蛋白存在于细胞液、内质网、线粒体、叶绿体和细胞核中功能：能专一与细胞中非天然构象的蛋白质相互作用，与合成中的肽链结合，介导各功能域或整个蛋白质分子的正确折叠。能与细胞液中合成的线粒体及叶绿体蛋白质结合，使其肽链保持伸展状态而被跨膜运转。第十五页，共二十六页，编辑于2023年，星期五在应激状态下，能与非天然构象的蛋白质结合，稳定其结构，防止蛋白质变性导致内部疏水基团暴露而发生不可逆的凝集。2．伴侣蛋白的分类：根据伴侣蛋白的结构，分为几个家族；1)Stress-70家族：结构特点：分子量约70kd，由两个结构域组成，N-末端结构域高度保守，具有腺苷三磷酸酶ATPase活性。C-末端结构域保守性差。Stress-70家族的热休克蛋白Hsp70在热休克中的作用，目前研究较广泛。第十六页，共二十六页，编辑于2023年，星期五功能：Stress-70家族蛋白能识别和结合新合成的蛋白质肽链，使之稳定，以防止错误折叠和聚集。在蛋白质合成结束，就被从Stress-70蛋白上释放出来，并折叠成天然态。从Stress-70蛋白上释放结合的肽链需要能量，是来自于Stress-70蛋白结合的ATP的水解。第十七页，共二十六页，编辑于2023年，星期五2)Chaperonin家族Chaperonin家族蛋白广泛存在于细胞中，在热休克、细菌感染等都能引起该族蛋白在细胞内增加。结构特点：Chaperonin家族蛋白有两种氨基酸顺序相关的类型，大的叫Chaperonin-60(cpn-60)亚基分子量60kd，由17个相同的亚基组成的；小的叫Chaperonin-10(cpn-10)亚基分子量10kd，由7个亚基组成的。第十八页，共二十六页，编辑于2023年，星期五作用：Chaperonin家族蛋白的作用是促进与其结合的蛋白质肽链的折叠或装配成天然态，识别的位点不是靶蛋白的氨基酸顺序或天然态，而是它们的部分折叠的非天然态，并提供一个表面或工作台面，在其上结合非天然态蛋白质，然后通过一系列ATP水解，完成被结合的非天然态蛋白质的正确折叠或装配。第十九页，共二十六页，编辑于2023年，星期五伴侣蛋白如何协助新生蛋白质肽链正确折叠？Stress-70蛋白的作用是结合、位点合成的蛋白质肽链，维持其处于部分的状态，一旦合成完成，就将其释放。这种被释放出来的部分折叠的肽链立即被Chaperonin家族蛋白所捕捉并催化它正确折叠成天然态。一个合成的蛋白质肽链，可能依赖于一个或多个分子伴侣，或者不同的分子伴侣按前后次序工作，最后导致其折叠成为有特定的三维结构和生物功能的蛋白质分子。第二十页，共二十六页，编辑于2023年，星期五3．钙联接蛋白介导糖蛋白肽链的折叠：糖蛋白合成在内质网上，肽链一边合成、一边糖基化、一边折叠。糖蛋白的正确折叠与能识别糖基化状态的伴侣蛋白有关。这种伴侣蛋白需要钙离子的结合才能发挥其功能.称为钙联蛋白(Calnexin)。钙联蛋白的特征：属于I型膜蛋白，C-末端位于胞液，有磷酸化位点，N-末端位于内质网腔中，能与钙离子和靶蛋白结合，介导糖蛋白正确折叠。未折叠或错误折叠的肽链能被葡萄糖基化，含有葡萄糖基的肽链能被钙联蛋白识别和结合，葡萄糖基被切除，正确折叠的肽链不会再被葡萄糖基化，从而不能被钙联蛋白结合。钙联蛋白的活力受到钙离子和磷酸化的调节，钙联蛋白与靶蛋白的结合需要ATP酶作用。

第二十一页，共二十六页，编辑于2023年，星期五第六节、生物工程中的蛋白质折叠：一、包含体(inclusionbodies)生物工程成就就是要使外源基因在大肠杆菌中成功克隆和表达。那么表达产物－蛋白质是否具有生物活性是生物工程中一个必要解决的问题。包含体：在大肠杆菌细胞内表达的外源基因蛋白质是以“变性”的无活性的蛋白质形式存在、沉积于细胞内,这种无定形的蛋白质聚体,它们不被如何膜所包围,称为包含体.包含体的形成实际上是蛋白质折叠中中间态的“非专一性聚集”。第二十二页，共二十六页，编辑于2023年，星期五UIN伸展态中间态天然态

A(包含体)第二十三页，共二十六页，编辑于2023年，星期五二、包含体形成的机理：

蛋白质生物合成翻译产物蛋白质折叠稳定构象不稳定构象可溶性可溶性不溶性稳定降解包含体第二十四页，共二十六页，编辑于2023年，星期五三、形成包含体在生物工程中的意义：形成包含体，呈致密的颗粒，不易溶解，易纯化。包含体的形成，保护表达产物不被蛋白质水解酶降解。包含体成分是正确表达的肽链组成，用变性剂增溶成为可溶性的伸展肽链，然后在适当的条件下折叠成天然有活性的蛋白质分子，从而达到生物工程的最终目的。第二十五页，共二十六页，编辑于2023年，星期五蛋白质结构与功能要求：选择某种蛋白质或酶理化