细胞工程染色体工程详解演示文稿

细胞工程染色体工程详解演示文稿本文档共49页；当前第1页；编辑于星期日\22点25分（优选）细胞工程染色体工程本文档共49页；当前第2页；编辑于星期日\22点25分染色体变异：在真核生物的体内，染色体是遗传物质DNA的载体。当染色体的数目发生改变时（缺少，增多）或者染色体的结构发生改变时，遗传信息就随之改变，带来的就是生物体的后代性状的改变，这就是染色体变异。它是可遗传变异的一种。根据产生变异的原因，它可以分为结构变异和数量变异两大类。一、染色体变异本文档共49页；当前第3页；编辑于星期日\22点25分本文档共49页；当前第4页；编辑于星期日\22点25分(一)染色体数目变异：染色体组（genome）：一个配子的全部染色体。细胞中的一组非同源染色体，它们在形态和功能上各不相同，但是携带着控制一种生物生长发育、遗传和变异的全部信息，这样的一组染色体，叫做一个染色体组整倍体(euploid)：体细胞内含有完整的染色体组的类型非整倍体（aneuploid）：染色体组内个别染色体数目有增减，使细胞内的染色体数目不是基数的完整倍数。多倍体（polyploid）：每个体细胞含有3个或更多染色体组的个体，3，4，5，6，8倍体二倍体(diploid)：具有两个染色体组的个体单倍体(haploid)：体细胞内含有配子染色体数目的个体本文档共49页；当前第5页；编辑于星期日\22点25分二倍体多倍体单倍体非整倍体本文档共49页；当前第6页；编辑于星期日\22点25分（二）染色体结构变异：易位translocation：染色体的某一片段移接到另一条非同源染色体上或同一条染色体上的不同区域

缺失deletion：染色体上某一区段及其带有的基因一起丢失倒位inversion：染色体上某一区段连同带有的基因顺序发生180度倒转重复replication：一个染色体上增加了相同的某个片断本文档共49页；当前第7页；编辑于星期日\22点25分在自然条件和人为条件改变的情况下，染色体结构的改变和染色体数目的增减，都将导致生物性状的变异。染色体工程：按照人们的需要对生物的染色体进行操作，添加、消减或替换染色体，从而达到定向选育新品种或创造人工新物种的目的。动物染色体工程主要包括染色体倍性改造、结构改造及人工染色体的利用等技术。本文档共49页；当前第8页；编辑于星期日\22点25分二、动物染色体倍性改造

染色体倍性改造工程是指有目的、有计划地增加或减少一组或几组同源或异源染色体，以创造动植物新品种的一项染色体工程技术，主要包括多倍体育种和单倍体育种。本文档共49页；当前第9页；编辑于星期日\22点25分（一）动物的多倍体育种（1）染色体加倍技术（2）多倍体的倍性鉴定（3）动物多倍体育种的意义本文档共49页；当前第10页；编辑于星期日\22点25分

多倍体polyploid：每个体细胞含有三个或更多染色体组的个体，3，4，5，6，8倍体。在自然界高等植物中较常出现，而动物界较少。

当所有的基本染色体组都来自同一物种的多倍体称为同源多倍体(autopolyploid)

染色体组来自不同物种的多倍体称为

异源多倍体(allopolyploid)。本文档共49页；当前第11页；编辑于星期日\22点25分（1）染色体加倍技术

1939年，Frankhauser和Griftiths首先在两栖类中成功地诱发了三倍体。由于多倍体动物具有生长速度快，成活率高及抗病能力强等特点，所以人工诱导多倍体，改善动物经济性状倍受重视。现在，该技术已成为低等经济动物育种的主要技术之一，其成果已经应用于生产实践，取得了明显的经济效益和社会效益。本文档共49页；当前第12页；编辑于星期日\22点25分

多倍体是由细胞内染色体加倍而形成的，即通过抑制受精卵第二极体的放出，产生三倍体或抑制第一次卵裂产生四倍体，可以利用生物、化学和物理的方法得到多倍体:1)化学诱导方法：化学物质如细胞松弛素B等常用的动物多倍体诱导剂。

2)物理学方法：包括温度休克法、水静压法和高盐高碱法等。

3)生物学方法：杂交尤其是种间杂交获得异源多倍体。本文档共49页；当前第13页；编辑于星期日\22点25分1)化学诱导方法：

有些化学物质也可以用来阻止第二极体的排出或受精卵的有丝分裂而产生三倍体或四倍体。

•细胞松弛素Bcytochalasin

抑制肌动蛋白聚合成微丝，从而抑制细胞质分裂。是最常用的动物多倍体诱导剂。

•秋水仙碱colchicine抑制细胞分裂中纺锤丝的形成，因而抑制有丝分裂，这在植物中已经广泛应用。

其它药物麻醉剂如N2O和聚乙二醇等。

缺点：化学药品一般比较昂贵、且具有毒性，影响处理后的胚胎发育，同时加上化学药物诱导产生的多倍体往往是在育种上没有价值的镶嵌体，所以化学方法在实际中的应用不及物理方法。本文档共49页；当前第14页；编辑于星期日\22点25分2)物理学方法•温度休克法：冷休克法（0～5度）和热休克法（30度左右）。

定义：用略高于或略低于致死温度的冷或热休克来诱导三倍体或四倍体的方法。

关键：能否成功阻止第二次成熟分裂或第二极体的排出。要达到这一点，必须考虑温度处理的开始时间（TA）、处理持续时间（D）和处理温度（T）三个因素。以及能否抑制受精卵的卵裂。

目前对鱼类使用温度休克法诱导三倍体的工作报道较多。一般来说，冷水性鱼类如鲑科种类应用热休克法、而温水性鱼类用冷休克效果较好。

优点：廉价、易操作，是诱导动物细胞多倍体化的常用手段，也有利于大规模生产使用。本文档共49页；当前第15页；编辑于星期日\22点25分

•水静压法：采用较高的水静压（65kg/cm2）来抑制第二极体的放出或第一次卵裂产生多倍体。

这种方法诱导率高（一般在90％～100％）、处理时间（3～5min）短，对受精卵损伤小、成活率高。

但是，该法需要专门的设备——水压机，成本较高，其样品室容量有限，处理卵的量有限，所以不适于大规模生产的。

本文档共49页；当前第16页；编辑于星期日\22点25分3）生物学方法生物学上主要通过杂交尤其是种间杂交获得异源多倍体。

例如用雌性草鱼（2n＝48）与雄性三角鲂（2n＝48）杂交可以获得子一代草鲂杂种三倍体。

这种不同科、属、种之间的远源杂交、会导致第二极体不排出，而产生多倍体。本文档共49页；当前第17页；编辑于星期日\22点25分（2）多倍体的倍性鉴定

染色体计数（直接法）——是鉴定多倍性的一个准确的直接方法。质量好的染色体标本可以从胚胎获得，因为胚胎的分裂指数高。

DNA含量测定（直接法）——流式细胞仪（flowcytomety）是测定DNA含量比较准确的方法。本文档共49页；当前第18页；编辑于星期日\22点25分

体积测量——一般，细胞核大小与染色体数目成比例增加，而且为维持恒定的核质比例，随着细胞核的、增大，细胞大小也按比例增加。因此组成多倍体有机体的细胞及细胞核通常要比二倍体大一些。但多倍体的器官或身体并不一定都比二倍体大。（间接法）例如，鱼多倍体常通过测量红细胞来鉴定其多倍性。为了更准确地反映倍性常和直接法结合使用。另外，用蛋白质电泳、通过对血液化学组成成分以及酶的含量的生化分析也可用于多倍体的鉴定。（间接法）本文档共49页；当前第19页；编辑于星期日\22点25分（3）动物多倍体育种的意义

•许多诱导的多倍体动物如两栖类、鱼类、贝类等具有良好的生存力和生长率。

低等动物种间杂交优势明显（生长快、具有两个不同种的优良特性），但成活率较低。三倍体可增加种间杂种的存活率。

•利用三倍体不育的特性，将生殖腺发育消耗的能量用于动物生长……•多倍体育种技术方法简单，具有潜在的理论和应用价值。四倍体与二倍体杂交获得的三倍体与二倍体存率活率相当。是产生三倍体的好办法。难点：准确的处理时间、诱导率、成活率、孵化率、倍性鉴定方法等还未解决本文档共49页；当前第20页；编辑于星期日\22点25分（二）动物的单倍体育种单倍体育种：就是指利用人工的方法进行单性生殖。不仅能够为研究发育机制提供特殊的途径，而且在养殖动物的繁育上还有能够创造具有特殊经济价值的单性群体（如母鸡、奶牛及雄蚕）。本文档共49页；当前第21页；编辑于星期日\22点25分

（1）人工单性生殖人工单性生殖方法主要包括

1）雌核发育（gynogenesis）

2）雄核发育（androgenesis）

本文档共49页；当前第22页；编辑于星期日\22点25分1）雌核发育（gynogenesis），俗称假受精，意指精子虽然正常地钻入和激活卵子，但精子的细胞核并未参与卵球的发育，精子的染色体很快消失，胚胎的发育仅在母体遗传的控制下进行。

自然界中动物天然存在的雌核发育频率极低。在一些无脊椎动物和鱼类等存在。本文档共49页；当前第23页；编辑于星期日\22点25分1911年，赫特威氏Hertwig就第一个成功地人工消除了精子染色体活性，并发现了“赫特威氏效应”。辐射剂量在极限以下，精子和受精胚胎均正常，辐射剂量渐增，胚胎存活率下降，继续增加辐射剂量，回复到正常卵裂，胚胎存活率提高。本文档共49页；当前第24页；编辑于星期日\22点25分本文档共49页；当前第25页；编辑于星期日\22点25分2）雄核发育（androgenesis）是指因经过紫外线、X

射线或γ射线处理的卵子与正常的精子受精，再在、适当时间施以冷、热或高压等物理处理，使进入卵子内的精子染色体加倍，而发育成为完全为父本性状的二倍体。雄核发育的个体的生存率非常低，这是由于精子基因型的纯合性、卵子由于照射的损伤和阻止第一次卵裂处理的损伤等原因造成的。但是仍旧在遗传学基础理论和育种中都有一定的价值，对YY雄性引起的性别控制等也有特殊的意义。

本文档共49页；当前第26页；编辑于星期日\22点25分（2）人工诱导雌核发育的方法人工诱导雌核发育是指用经过紫外线、X射线或γ射线等处理后的失活精子来“受精”，再在适当时间施以冷、热、高压等物理处理，以抑制第二极体的排出，使卵子发为正常的二倍体动物。

凡雌核发育的个体，都具有纯母系的单倍体染色体组，依赖于卵子染色体组的二倍体化。本文档共49页；当前第27页；编辑于星期日\22点25分雌核发育的关键问题

要达到实验性二倍体雌核发育目的，必须解决两个最主要的问题：

1)人为地使精子的遗传物质失活

2)雌核的二倍体化

本文档共49页；当前第28页；编辑于星期日\22点25分1）精子遗传物质的失活不同种类的物理辐射和化学药品的处理都可以导致精子遗传物质的失活。

物理辐射包括γ射线（通常用60Coγ）、X射线和紫外线。

γ射线（通常用60Coγ）和X射线具有较高的穿透力，能诱使染色体断裂。

紫外光能诱使胸腺嘧啶二聚化，这一过程能在光作用下修补复活。

化学方法：采用化学物质如

甲苯胺蓝、乙烯尿素和二甲基硫酸等化学物质消除精子染色体遗传活性。此外，还可采用显微手术直接除去受精卵雄性原核。本文档共49页；当前第29页；编辑于星期日\22点25分2）雌核的二倍体化

利用保留卵球第二极体或者阻碍受精卵早期有丝分裂，都可以实现二倍体化。如前节所述，利用温度、压力或化学方法可以诱使卵球二倍体化，如冷休克、热休克、流体静水压、细胞松弛素B等。

本文档共49页；当前第30页；编辑于星期日\22点25分（3）雌核发育的鉴别经人工或自然诱导的雌核发育个体，需经一定的鉴定，以证明它确属雌核发育的个体，精子在胚胎发育中确实没有在遗传方面做出贡献。

鉴别雌核发育的个体，通常以颜色、形态以及生化等方面的指标为依据。例如，鲤鱼中，用辐射处理正常全鳞片鲤鱼的精液，授予具散鳞片类型的鲤鱼卵，获得100%散鳞片子代，表明为100%的雌核发育个体。

通过细胞学的研究能更精确的判别雌核发育。若是雌核发育，其囊胚细胞中只出现一套来自雌核的染色体，否则雌核和雄核染色体各占一半，得到的是杂交种。

本文档共49页；当前第31页；编辑于星期日\22点25分本文档共49页；当前第32页；编辑于星期日\22点25分（一）动物染色体结构的改造的方法

1.放射线诱导放射线诱导可以使染色体产生缺失、易位、倒位、复制及基因内的点突变。

例如，利用ES细胞诱导产生突变，再将带有突变的

ES细胞植入小鼠的囊胚，从而产生带有突变的个体，进一步进行功能的研究。

Thomas等用此方法在小鼠的9号染色体的

Ncam位点，产生了一系列的缺失突变，缺失的大小都在3cM以下，有的可达35cM,缺失图谱几乎包括了9号染色体的一半，为研究9号染色体的功能提供了很好的材料。放射线诱导产生的突变不能定位，随机发生。三、动物染色体结构的改造本文档共49页；当前第33页；编辑于星期日\22点25分2.Cre/loxP介导染色体重组

Cre/loxP是一种常用的重组系统。Cre重组酶是在噬菌体P1中发现的一个38kDa的蛋白质，其名称来源于causerecombination，它能识别34bp的特异序列（loxP

）,介导两个loxP之间的序列发生重组，此过程不需要任何其他辅助因子的帮助，loxp的位置和方向不同，Cre重组酶介导形成的产物亦不同，可以导致染色体的删除/整合、倒位、易位，实现染色体的定点操作。本文档共49页；当前第34页；编辑于星期日\22点25分loxP

（locusofcrossingover(x)inp1）的序列特征：

LoxP位点是一段含有34个碱基对的序列，其两端为13bp的反相重复序列，之间有一个8bp的不对称核心序列，决定LoxP的方向。本文档共49页；当前第35页；编辑于星期日\22点25分

一个线形DNA分子或染色体上有两个同向的loxP位点时，经Cre酶作用，位点之间的片段被环化，游离于线形DNA分子或染色体之外，此时线形分子或染色体和环状分子上各留一个loxP位点。

——删除上述过程的逆向过程就是一种整合的过程。——整合

本文档共49页；当前第36页；编辑于星期日\22点25分一个线形DNA分子或染色体上有两个反向的loxP位点时，Cre酶作用后发生位点之间片段的倒位——倒位本文档共49页；当前第37页；编辑于星期日\22点25分

两个线形DNA分子或染色体上各有一个或两个同向的loxP位点时，Cre酶可导致分子间片段的转位。——易位本文档共49页；当前第38页；编辑于星期日\22点25分（二）染色体易位工程实例雄蚕茧比雌蚕茧出丝率高20%以上，体质比雌蚕要强壮，养蚕生产上所用一代杂交种如果全是雄蚕，那么既不增加成本，又不需要多费劳力就可增加10%-15%的蚕丝。近年来，运用辐射诱变和染色体工程手段先后培育出有性别标记的限性蚕品种。目前生产上可利用的有卵色限性系、斑纹限性系和茧色限性系。本文档共49页；当前第39页；编辑于星期日\22点25分卵色限性系：

家蚕有28对染色体，性染色体组型为ZW型，雌蚕（ZW），雄蚕（ZZ）。

用辐射诱发两个第10染色体向w染色体易位的品系。

其中一个在易位的第10号染色体片段上含有白卵基因ω3

另一个含有白卵基因ω2

+ω2和+ω3

有互补作用，只有同时存在是才表现黑卵

ω2和

ω3

均为隐性基因，只要其中一个成为纯合体时便表现为白卵。

这种易位雌蚕同持有ω2/ω2和

ω3/ω3

的雄蚕交配，分别得到黑雌卵和白雄卵。本文档共49页；当前第40页；编辑于星期日\22点25分

采用这样的品系繁殖时，可由光电选卵机多选雄卵孵化，提高产率，降低成本。本文档共49页；当前第41页；编辑于星期日\22点25分四、人工染色体

人工染色体(artificialchromosome)指人工构建的含有天然染色体基本功能单位的载体系统。人工染色体研究的兴起是染色体工程的一个里程碑。在对真核生物进行基因克隆、基因转移，以及建立真核生物染色体图的过程中，都要求基因载体的大容量和在真核细胞中的比较稳定地持续地传代，以保证所克隆基因的完整以及对宿主染色体的整合（integration）。目前正在研究或应用的有：yeastartificialchromosome(YAC)、(Bacterialartificialchromosome，BAC)以及mammalianartificialchromosome。本文档共49页；当前第42页；编辑于星期日\22点25分（一）酵母人工染色体yeastartificialchromosome(YAC)1982年Szostake与Blackburn指出染色体要确保在细胞分裂中保持稳定，必须能够自我复制和向子细胞平均分配，它需要3个关键序列：自主复制DNA序列(autonomousreplicationsequences,ARS)，DNA复制的起点；端粒DNA序列（telomereDNAsequences，TEL），结束复制，确保染色体的独立性和稳定性；着丝粒DNA序列（centromereDNAsequences)确保染色体在细胞分裂时能平均分配到子细胞中。1983年Murray等人首次成功构建了包括着丝粒、端粒、复制子和外源DNA总长度为55Kb的酵母人工染色体。本文档共49页；当前第43页；编辑于星期日\22点25分1981年，Burke等人构建了能克隆大片段人体DNA分子的载体YAC，证明YA