差别显示技术详解

差别显示技术详解演示文稿本文档共20页；当前第1页；编辑于星期六\4点9分优选差别显示技术本文档共20页；当前第2页；编辑于星期六\4点9分

高等生物大约有3~5万个不同的基因，在每一个正常的体细胞中都含有相同的基因组拷贝，但在不同的组织细胞中仅有10%~20%的少部分基因被选择性表达，这种选择性表达是在发育过程中细胞分化的根本原因，是调控细胞生命活动过程的核心机制。因此，比较不同组织之间，或相同组织在不同生理条件下，或胚胎在不同的发育阶段的基因表达差异，可分离并克隆出这些特异性表达的基因。近年来，该领域的研究取得了很大进展，扣除杂交（subtractivehybridization,SH）、基因芯片技术（DNAchiptechnique）、基因表达的系统分析(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)、噬菌体全套抗体库技术(phagedisplayantibodyrepertoirelibrarytechnique)和双向电泳技术(two-dimensionalgelelectrophoresis)先后成功地建立。一.概述本文档共20页；当前第3页；编辑于星期六\4点9分基因表达调控的一种方式。指在对信号或诱导物做出应答时，选择表达不同的基因，或使基因的表达水平有所不同。基因差异表达本文档共20页；当前第4页；编辑于星期六\4点9分DD的发明及其基础由Liang于1992年创立是分离差异表达基因强有力的工具在随后几年里，Liang等在技术方面做了大量改进，使技术更适用、更简便基于RT-PCR理论，依赖于3种技术1）RT-PCR技术2）以特定引物进行的PCR技术3）DNA电泳技术

本文档共20页；当前第5页；编辑于星期六\4点9分二.基本概念

mRNA差别显示技术也称为差示反转录PCR（DifferentialDisplayofreverseTranscriptionalPCR）简称为ddRT-PCR。它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。目前已广泛应用于分离鉴定组织特异性表达的基因。本文档共20页；当前第6页；编辑于星期六\4点9分

反转录PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR）又称为逆转录PCR。其原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。RT-PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。反转录PCR本文档共20页；当前第7页；编辑于星期六\4点9分RNA指纹

RNA首先在逆转录酶的作用下使RNA逆转录为DNA，之后以其DNA为模板，通过以DNA指纹技术建立指纹图谱进行分析。DNA指纹

某些DNA序列的差异可通过限制性酶切片段长度的改变反映出来，此即限制性片段长度多态性(RFLP)。其主要原因是由于DNA序列个别碱基的突变而引起某个限制性内切酶识别位点的获得或丢失，表现为不同长度的酶切片段．本文档共20页；当前第8页；编辑于星期六\4点9分水稻品种DNA指纹本文档共20页；当前第9页；编辑于星期六\4点9分基本原理

利用所有真核基因的mRNA的3’端都有一段多聚腺苷酸poly(A)尾结构的特点，将不同来源的总mRNA反转录合成cDNA,此cDNA合成是采用oligo(dT)12MN为引物，其中M为A,C,G中的任意一种，N为A,C,G或T中的任意一种，共有12种oligo(dT)12MN引物，其中M为锚定碱基可增大引物的Tm值，N称为分类碱基，对反转录进行分类。用这12种引物分别对同一总mRNA样品进行cDNA合成，即进行12次不同的反转录反应，得到12种类型的cDNA，从而也将总mRNA分为12个亚群。在此基础上对每一类cDNA进行随机引物和相应的反转录引物PCR扩增，由于扩增的cDNA片段被放射性同位素标记，因而利用放射自显影技术通过对不同组织样品的同一类cDNA的PCR选择性扩增产物进行凝胶电泳分析，从而反映出不同样品间基因的时间和空间上的组织特异性的表达。本文档共20页；当前第10页；编辑于星期六\4点9分

基本原理是，几乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端，都带有一个多聚的腺苷酸结构，即通常所说的poly(A)尾巴。因此，在RNA聚合酶的作用下，可按mRNA为模板，以oligo(dT)为引物合成出cDNA拷贝。根据mRNA分子3’-末端序列末端结构的分析可以看到，在这段poly(A)序列起点碱基之前的一个碱基，除了为A的情况之外，只能有C、G、T三种可能。根据这种序列结构特征，P.Peng等人设计合成三种不同的下游引物，它由11个或12个连续的脱氧核苷酸加上一个3’-末端锚定脱氧核苷酸组成，用5’-T11G、5’-T11C、5’-T11A表示，这样每一种此类人工合成的寡核苷酸引物都将能够把总mRNA群体的1/3分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。于是，采用这三种引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上分成三个亚群体。然后用一个上游的随机引物和与反转录时相同的oligo(dT)引物对这个ｃＤＮＡ亚群体进行ＰＣＲ扩增，因为这个上游的引物将随机结合在cDNA上,因此来自不同ｍＲＮＡ的扩增产物的大小是不同的，可以在测序胶上明显分辨开来，从而筛选出不同样品间基因差异表达的DNA片段。本文档共20页；当前第11页；编辑于星期六\4点9分本文档共20页；当前第12页；编辑于星期六\4点9分5’

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly(A)RNA5’T12MN3’锚定引物逆转录5’

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’变性5’

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’退火5‘T12MN3’锚定引物寡核苷酸随机引物3‘MNTTTTTTTTTTTT5’延长dNTP、Taq聚合酶3‘MNTTTTTTTTTTTT5’5’M’N’AAAAAAAAAAA3’变性、退火、延伸电泳显示T12MN(M为A、G、C，N为A、T、G、C)

启动cDNA第一链合成不同长度的PCR产物回收差异条带，再扩增，克隆测序，同源比对随机结合到cDNA链上本文档共20页；当前第13页；编辑于星期六\4点9分(1)提取总RNA，在这个步骤中注意不能有DNA污染，一般用无RNA酶的DNA酶在37℃下处理30min；(2)在逆转录酶作用下，以OligoT11MN为引物(M为G、A、C中的任一种，N为A、C、G、T任一种)，进行逆转录；(3)PCR反应，扩增cDNA的第一条链；(4)扩增后的cDNA进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，使差异表达的cDNA片段在6%测序胶上分开；(5)找出不同处理间差异显示的条带，从胶上切割下来，并回收，再进行第二次扩增；(6)克隆差异片段，差异片段可作为探针；(7)Northern杂交，验证目的片段，去掉假阳性片段；(8)对目的片段进行测序；(9)以克隆的目的片段为探针，从基因组文库中筛选出相应的全长基因。技术一般步骤本文档共20页；当前第14页；编辑于星期六\4点9分mRNA差异显示技术简略流程图本文档共20页；当前第15页；编辑于星期六\4点9分本文档共20页；当前第16页；编辑于星期六\4点9分放射性自显影技术放射性自显影法与普通照相的曝光、显影、定影原理相似，此法是利用放射性同位素所放出之射线使照相乳胶“感光”，再经显影和定影处理，将乳胶中因受辐照而致敏的卤化银颗粒还原成金属银，洗去未“感光”的卤化银后则图像自然显示出来。图像中任何区域的黑度取决于留存的金属银的量，它反映了射线在这个区域所沉积的能量。记录、检查和测量整体和组织、细胞和亚细胞水平中放射性示踪物的分布、进行定性和半定量测定，称为放射自显影法。

本文档共20页；当前第17页；编辑于星期六\4点9分DD的优点以RT-PCR和DNA凝胶电泳为基础灵敏度高，仅需0.2μg的总RNA因为从两种或更多的特定组织样品来源的扩增产物在同一块胶上鉴定，因此能用于鉴定特定组织或细胞来源样品之间转录水平的mRNA的定性和定量变化可以同时检测到“上调”及“下调”的基因时间短，实验过程中可步步验证比较可进行多基因家族的表达分析

本文档共20页；当前第18页；编辑于星期六\4点9分DD的缺点

每种技术的诞生都不可能是完美的，mRNA差异显示技术虽然从创立时起就很受欢迎，但是许多研究者发现该技术存在一定缺陷，其中三点较为突出：第一，操作步骤多，外源DNA污染严重而导致假阳性率高，即差异片断用Northern杂交时无阳性信号，重复稳定性较差。据研究，这种假阳性率可高达70％第二，获得的差异条带短小，多为300bp左右，并且多为3’端非编码区序列（UTR），难以直接判断其功能和意义。第三，必须采用放射性同位素标记反应，使得实验周期长、成本高、易造成同位素污染，且不好回收差异片断。本文档共20页；当前第1