第二章食品微生物鉴定技术和方法

第二章食品微生物鉴定技术和方法第一页，共五十七页，编辑于2023年，星期四微生物纯培养的获得的方法稀释涂布法划线分离法利用平皿的生化反应分离法：透明圈法、变色圈法、生长圈法、抑菌圈法“病灶”分离法单细胞或单孢子分离法特殊菌类——环保降解菌的分离第二章食品微生物鉴定技术和方法第一节食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法第二页，共五十七页，编辑于2023年，星期四微生物的分离、纯化与接种技术接种和分离工具1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀

第三页，共五十七页，编辑于2023年，星期四微生物的分离、纯化与接种技术第四页，共五十七页，编辑于2023年，星期四划线接种，分离纯化第五页，共五十七页，编辑于2023年，星期四灼烧第六页，共五十七页，编辑于2023年，星期四第七页，共五十七页，编辑于2023年，星期四微生物纯培养的获得的方法无氮培养基——筛出固氮菌；无有机碳源的培养基——筛出硝化细菌；无有机碳源的培养基且无氧有光环境——筛出光合细菌；高浓度NaCl的培养基——筛出耐盐菌株伊红—美蓝的培养基——筛出大肠杆菌；青霉素的培养基——筛出酵母菌、霉菌；……第二章食品微生物鉴定技术和方法第一节食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法第八页，共五十七页，编辑于2023年，星期四微生物纯培养的获得的方法

传统发酵食品的starter的确定or优势菌株的确定例如：金华火腿的主要发酵菌；

优势细菌：乳酸菌、葡萄球菌优势酵母菌：欧诺比假丝酵母、红酵母微生物生态学方面的菌株确定？？非原位检测鉴定、原位检测鉴定第一节食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法第九页，共五十七页，编辑于2023年，星期四检测食品中微生物总数的方法4种基本方法：（1）标准平板计数或好氧平板计数，适用于活细胞或菌落形成单位。（2）最大可能值法。作为一种统计学的方法来测定活性细胞。（3）染色还原技术。估计拥有还原能力的活性细胞数目。（4）直接显微镜计数法。活性和非活性细胞。第十页，共五十七页，编辑于2023年，星期四常规的标准平板计数（SPC）

将一部分食品样品混合或者均质化，在适当的稀释液中进行梯度稀释，然后涂布或者倾注到适宜的琼脂培养基上，在适当的温度下培养一段时间后，使用电子计数器对可见的菌落进行计数。SPC法是目前测定活细胞数和食品产品中菌落形成单位数最广泛的方法。检测食品中微生物总数的方法第十一页，共五十七页，编辑于2023年，星期四常规的标准平板计数（SPC）记录产品中全部活细胞时，要考虑以下因素：1）采用的取样方法2）食品样品中有机体的分类3）食品生物区系的种类4）食品原料的种类5）食品产品的预检历史记录6）所用培养基的营养程度7）所用的培养温度和时间8）pH值、aw和培养基的氧化还原电位9）所用的稀释液类型10）食品样品中有机体的相对数量11）竞争或拮抗有机体的存在检测食品中微生物总数的方法第十二页，共五十七页，编辑于2023年，星期四显微镜菌落计数法

是通过显微镜对载玻片琼脂层上生长的微小菌落计数。首先进行涂布，将0.1ml的牛乳琼脂混合物涂布到4cm2的载玻片上，经培养，干燥和染色，借助显微镜对微小菌落进行计数。另一种方法是将2ml融化的琼脂与2ml热牛乳混合，随后取0.1ml已经接种的琼脂涂抹到44cm2的载玻片上，最后用硫堇蓝染色，用16mm物镜的宽视野显微镜观察载玻片。检测食品中微生物总数的方法第十三页，共五十七页，编辑于2023年，星期四最大可能数法

在这种方法中，食品样品的稀释液的准备类似于SPC法。将三个连续等分量样品或稀释梯度的稀释液转移到9个或15个有适宜培养基的试管中，分别称为3试管或5试管法。最初样品中微生物的数量通过查阅标准MPN表来获得。通常MPN法的结果高于SPC的结果。检测食品中微生物总数的方法第十四页，共五十七页，编辑于2023年，星期四MPN法的优点：（1）这种方法相对比较简单（2）与SPC法相比，不同实验室得到的结果更加可靠，相似率较高。（3）特殊微生物群体可以通过适当的选择性培养基进行测定。（4）这是一种测定粪大肠杆菌群含量的方法。缺点：精确度低。检测食品中微生物总数的方法第十五页，共五十七页，编辑于2023年，星期四染色还原试验

在估测相关产品中活菌数量时，通常使用两种染色剂：亚甲基蓝和刃天青。进行染色还原实验时，食品上清液加入任何一种染色剂标准溶液，亚甲蓝会从蓝色还原为白色，而刃天青则从暗蓝色还原为粉红色或白色，染色剂还原的时间与样品中微生物的数量成正比。检测食品中微生物总数的方法第十六页，共五十七页，编辑于2023年，星期四染色还原试验刃天青还原反应快速检测牛肉腐败，被还原为无色、有味、而且结果与SPC法显著相关。乳品中用来估测鲜牛乳的微生物学质量，简单，快捷，经济，而且只有活细胞才对显色剂有明显的还原能力。缺点：微生物对染色剂的还原程度不同，不适用于含还原酶的食品。第十七页，共五十七页，编辑于2023年，星期四食品表面微生物的检测1.棉拭/棉拭漂洗法是表面微生物检验中最古老、应用最广泛的方法，它不仅应用于食品及乳制品，而且还用于医院、饭店。方法：将1.5ml液体加到平整的表面上，在3cm2区域内擦拭15s，然后用微升移液管取0.1ml和0.5ml液体，将液体在平板计数琼脂或选择性培养基上涂布或倒平板计数。第十八页，共五十七页，编辑于2023年，星期四2.接触平板法

平板直接接触复制微生物法（RODAC）使用一种特殊的皮氏培养皿，平板中倾倒15.5－16.5ml培养基，形成琼脂平面；当把平皿倒置时，凝固的琼脂就会与待测表面直接接触，接触后盖上平皿盖、培养，然后进行菌落计数。缺点：仅适用于菌落较分散的表面，对于污染较严重的表面无效。食品表面微生物的检测第十九页，共五十七页，编辑于2023年，星期四3.琼脂注射/琼脂肠法琼脂注射法：将1个100ml的注射器去掉针头，改造成中空的柱体，并在中空的部分注入琼脂，通过推动活塞将琼脂从柱体底部挤压到待测表面上，将露在外面的那层切下，置于皮氏平皿中，经过培养后进行菌落计数。琼脂肠法：与注射法类似，只不过用的是塑料试管而不是改造的注射器。广泛用于肉制品或食品加工设备表面微生物的检测。缺点同RODAC法，适合菌落分散和表面污染程度较轻的样品。食品表面微生物的检测第二十页，共五十七页，编辑于2023年，星期四其他检测方法：1）直接表面检测法2）粘性薄膜法3）棉拭/琼脂斜面4）超声波装置5）喷雾枪法食品表面微生物的检测第二十一页，共五十七页，编辑于2023年，星期四第二章食品微生物鉴定技术和方法第一节食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法微生物传统的鉴定方法细菌：伯杰氏鉴定细菌学手册（第八版1974、第九版1994）、伯杰氏系统细菌学手册（第一版）1984~1989，2000年分五卷出版。放线菌：中国科学院微生物研究所编著的放线菌目分科、分属检索表真菌：Smith、Alexopoulos(阿历克索鲍罗斯）、Ainsworth（安斯沃思）的分类系统第二十二页，共五十七页，编辑于2023年，星期四第二章食品微生物鉴定技术和方法第一节食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法伯杰氏手册沿革：伯杰氏手册自从1923年出版第1版，直至1974年第8版，均使用《伯杰氏鉴定细菌学手册》(Bergey′sManualofDeterminativeBacteriology)。1984年开始至1989年分四卷出版，并改名为《伯杰氏系统细菌学手册》(Bergey'sManualofSystematicBacteriology)(第一版)1994年又将"系统手册"1-4卷中有关属以上分类单元的分类鉴定资料进行少量的修改补充后汇集成一册仍用原来书名出版，故称之为《伯杰氏鉴定细菌学手册》第九版第二十三页，共五十七页，编辑于2023年，星期四第二章食品微生物鉴定技术和方法第一节食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法第九版《伯杰氏细菌学手册》简介：内容分四卷：第1卷：一般医学和工业方面重要的革兰氏阴性细菌。第2卷：放线菌以外的革兰氏阳性细菌。第3卷：古细菌、蓝细菌及其他革兰氏阴性细菌。第4卷:放线菌。

第二十四页，共五十七页，编辑于2023年，星期四第一节食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法新的分类方法:数值分类、核酸在细菌分类中的应用、遗传学方法、血清学和化学分类等。鉴定方法的革新。新版在表型特征基础上，以DNA资料对属、种的分类地位给予决定性的判断。将DNA中G+Cmol％含量的测定、DNA杂交、RNA寡核苷酸的顺序分析、细胞化学分析、数值分类等方法应用到细菌的分类学上。第二十五页，共五十七页，编辑于2023年，星期四第二章食品微生物鉴定技术和方法第一节食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法应用原则查阅相关尽可能的资料每一步利用常识、结果判定最少的试验，最好的结果第二十六页，共五十七页，编辑于2023年，星期四第二章食品微生物鉴定技术和方法第一节食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法鉴定步骤菌株的纯化化能自养菌、光合菌or化能异养菌的确定根据分离的过程确定形态、Gram、Spore的确定色素等专一特性碳源的类型、氧化性、发酵性归属；由属的特征选择试验；进一步确定第二十七页，共五十七页，编辑于2023年，星期四第二章食品微生物鉴定技术和方法第一节食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法应用实例（a-淀粉酶抑制剂产生菌的分离、鉴定、保存）第一步：菌落纯菌株的获得第二步：设计一系列的检测反应第三步：对照结果定名第四步：保存生化反应平板筛选：“抑制圈和显色圈法”。第二十八页，共五十七页，编辑于2023年，星期四第二章食品微生物鉴定技术和方法1.DNA同源性和DNA中（G+C）摩尔分数（G+C)%=（G+C)/(A+T+C+G)%Tm法（热变温度法）测定菌株间相差2.5～4.0％；种间相差5～10％以上；属间相差10％以上第二节食品微生物学的现代鉴定方法第二十九页，共五十七页，编辑于2023年，星期四每个生物种都有特定的GC%范围，因此可以作为分类鉴定的指标。细菌的GC%范围为25--75%，变化范围最大，因此更适合于细菌的分类鉴定。第三十页，共五十七页，编辑于2023年，星期四

GC%测定主要用于对表型特征难区分的细菌作出鉴定，并可检验表型特征分类的合理性，从分子水平上判断物种的亲缘关系。G+C含量的比较主要用于分类鉴定中的否定但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它们之间具有近的亲缘关系。第三十一页，共五十七页，编辑于2023年，星期四

同一个种内的不同菌株G+C含量差别应在4～5%以下；同属不同种的差别应低于10～15%；

G+C含量已经作为建立新的微生物分类单元的一项基本特征，它对于种、属甚至科的分类鉴定有重要意义。

若二个在形态及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其G+C含量的差别大于5%，则肯定不是同一个种，大于15%则肯定不是同一个属。第三十二页，共五十七页，编辑于2023年，星期四第二章食品微生物鉴定技术和方法第二节食品微生物学的现代鉴定方法1.DNA同源性Southernblotting（DNA-DNA)Northernblotting(DNA-RNA)Westernblotting(Pro-Anti)Easternblotting

第三十三页，共五十七页，编辑于2023年，星期四第二章食品微生物鉴定技术和方法第二节食品微生物学的现代鉴定方法2.23S、16S、5SrRNA序列相似性核糖体70S

30S50S

16S213423S+5S蛋白质第三十四页，共五十七页，编辑于2023年，星期四第二章食品微生物鉴定技术和方法第二节食品微生物学的现代鉴定方法16S亚基保守性高，是细菌进化的计时器普遍存在细胞RNA含量较高rRNA稳定16sRNA序列保守16sRNA分子量适中16SrRNA基因约含有1540个核苷酸，分可变区和保守区，不同微生物可变区核苷酸序列不同，从而可以利用这些特异性序列进行微生物的鉴定；

第三十五页，共五十七页，编辑于2023年，星期四2023/6/2236

细

菌

域

Domainbacteria

古（生）菌域

Domainarchaea

真

核

生

物

域

Domaineukaryota

紫色细菌

线粒体

甲烷球菌属

甲烷杆菌属

真菌

植物

叶绿体

革兰氏阳性细菌

甲烷八叠球菌属

极端嗜盐菌

动物

蓝细菌

无硫绿细菌

热球菌属

伪变形虫

纤毛虫

黄杆菌

栖热胞菌属

热网菌属

热变形细菌

粘菌

鞭毛虫

产液菌属

微孢子

毛滴虫

双滴虫（假滴虫属）

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生物总系统发育树（根据16SrRNA序列比较绘制，引自《布氏微生物学》2000）第三十六页，共五十七页，编辑于2023年，星期四第二章食品微生物鉴定技术和方法第二节食品微生物学的现代鉴定方法具体测定方法：采用RNaseT1酶可以将16SrRNA酶解在G位点上切割，得到6～20个碱基大小的序列对这些6～20碱基片段进行分离、测序比较不同微生物之间SAB（Dice型相关系数）的相似性。

第三十七页，共五十七页，编辑于2023年，星期四第二章食品微生物鉴定技术和方法第二节食品微生物学的现代鉴定方法SAB=2×NAB/（NA+NB）NAB代表两菌所含相同寡核苷酸的碱基总数，NA和NB分别代表两菌寡核苷酸所含碱基总数SAB等于1，说明所比较的两菌株rRNA序列相同，是同一进化时间的微生物，若SAB值小于0.1，两菌亲缘关系很远第三十八页，共五十七页，编辑于2023年，星期四第二章食品微生物鉴定技术和方法第二节食品微生物学的现代鉴定方法分子生物学技术在细菌鉴定中的应用核酸探针技术核酸扩增技术（PCR技术）基因芯片技术第三十九页，共五十七页，编辑于2023年，星期四2023/6/2240

核酸探针技术原理：两条不同来源的核酸链如果具有互补的碱基序列，就能够特异性的结合而成为分子杂交链。据此，将己知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法标记，加入己变性的被检DNA样品中，在一定条件下即可与该样品中有同源序列的DNA区段形成杂交双链，从而达到鉴定样品中DNA的目的。

这种能认识到特异性核苷酸序列有标记的单链叫DNA分子核酸探针或基因探针。

第四十页，共五十七页，编辑于2023年，星期四

制备核酸探针要注意两个关键性的问题：1.要选择特异性强而又无交叉反应的核酸(DNA或RNA)片段，可通过核酸重组和克隆以及人工合成、PCR扩增等技术获得2.标记物，当前常用同位素(32P、35S等）、光生物素及地高辛(digoxigenin)标记。核酸探针技术已被用于检验食品中一些常见的病原菌。如产肠毒素性大肠杆菌、沙门氏菌。第四十一页，共五十七页，编辑于2023年，星期四2023/6/2242

PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，又称为无细胞克隆系统，是1985年由Mullis创建的一项DNA体外扩增技术。PCR的全过程由变性（denature）、退火（annealing）和延伸（extension）三步组成的若干个循环，每步之间通过温度的改变来实现转换。其基本原理是在体外对一特定的双链DNA片段（或称靶DNA)进行高效扩增。首先将靶DNA双链加热变性为单链，然后加入两段人工合成的与靶DNA两端邻近序列互补的寡核苷酸片段作为引物(primer)，即左端引物和右端引物，该对引物与互补的DNA单链碱基互补结合后，在有DNA多聚酶和四种dNTPs底物存在的情况下，引物沿模板DNA链（靶DNA单链）按5’→3’方向延伸，自动合成新的DNA双链。第四十二页，共五十七页，编辑于2023年，星期四2023/6/2243

PCR技术有快速、特异、敏感等特点，因而该技术在食品中致病菌的检测方面具有很大的应用潜力。PCR技术能快速地检出肉食品中的沙门氏菌，检测的敏感性和特异性均为100%，保证了检测的准确性。PCR还可用于多种病原微生物的同时检测或鉴定，它是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染。第四十三页，共五十七页，编辑于2023年，星期四2023/6/2244基因芯片（genechip）又称DNA微阵列（DNAmicroarray），是指将许多特定的寡居核苷酸片断或基因片段作为探针，有规律的排列固定于支持物上形成的DNA分子阵列。芯片与待测的荧光标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交后，在通过激光共聚焦荧光监测系统等对其表面进行扫描即可获取样品分子的数量和序列信息。由于该技术同时将大量的探针固定于支持物上，所以可以一次性对大量序列进行检测和基因分析，解决了传统的核酸印迹杂交（southernblot和northernblot等）操作复杂，操作序列数量少等缺点。基因芯片技术的突出特点在于其高度的并行性、多样化、微型化和自动化，以及灵敏、高效和低成本等优点。第四十四页，共五十七页，编辑于2023年，星期四第二章食品微生物鉴定技术和方法第二节食品微生物学的现代鉴定方法3.寡核苷酸种类4.可溶性蛋白质总量或形态学、生理生化特征的数值分类法5.细胞壁分析6.血清反应法7.细胞脂肪酸组成分析第四十五页，共五十七页，编辑于2023年，星期四第二章食品微生物鉴定技术和方法1.化学方法热稳定性核酸酶法（金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus））鲎试剂法（Limulusamoebocytelysate（LAL）assay）（适用于G-细菌）ATP测定法（适用于活细胞）辐射线测定法荧光或发色测定法第三节食品微生物快速检测技术第四十六页，共五十七页，编辑于2023年，星期四1.化学方法1）热稳定性核酸酶法（金黄色葡萄球菌（S.aureus））

通过测定食物中的热稳定性核酸酶可以检测出食物中存在的大量的金黄色葡萄球菌。这是由于其产生热稳定性核酸酶以及凝固酶。研究表明：有0.34单位的热稳定性核酸酶存在时，表明有某种金黄色葡萄球菌生长，而此时肠毒素的含量还不会导致食物中毒。0.34单位的热稳定性核酸酶相当于金黄色葡萄球菌产生9.5×10－3ug肠毒素。热稳定性核酸酶检测法可以作为指示金黄色葡萄球菌生长的方法。第三节食品微生物快速检测技术第四十七页，共五十七页，编辑于2023年，星期四1.化学方法

2）鲎试剂法鲎试剂法又称鲎变形细胞溶解物实验。革兰氏阴性菌可通过产生的内毒素进行鉴定，内毒素是由菌体外膜裸露的脂多糖和被外膜包围的脂A构成的。鲎变形细胞溶解物实验采用来自马蹄蟹血液的血细胞溶菌蛋白。溶菌蛋白是已知的对内毒素最敏感的物质。鲎实验是在少量的溶菌液中加入食物悬液或其他待测样品，并在37℃培养1h。内毒素的存在会导致胞溶物凝胶。鲎试剂能检出1.0pg脂多糖。由于大肠杆菌含有3.0fg脂多糖，所以能检出＜300个革兰氏阴性菌。第四十八页，共五十七页，编辑于2023年，星期四鲎试剂法鲎试剂法首次应用于食品检验是检测碎牛肉中的腐败菌。内毒素的滴定度随着革兰氏阴性细菌数量的增加而增加。由于冷藏鲜肉的变质通常是由革兰氏阴性菌引起的，所以鲎试剂法是快速检测革兰氏阴性菌总菌数的好方法。这种方法适合于评价巴氏杀菌前后乳的大肠菌群卫生质量。第四十九页，共五十七页，编辑于2023年，星期四3）ATP法ATP在细胞死亡2h后消失，并且每个细菌细胞中的ATP含量恒定，每个细胞约含有10－18－10－17mol，相当于105cfu的细菌含有4×104mol/LATP。一种最简单的ATP测定法之一是利用萤火虫的虫荧光素－荧光素酶系统测定。在ATP存在时，用荧光检测器检测荧光素酶发射的荧光强度。萤火虫荧光素的发光量与添加的ATP量成正比。在106－109cfu/g范围内，微生物的ATP含量和细菌数呈线性关系。ATP法已经用于鸡肉、猪肉和牛肉的检测。（cfu/mL指的是每毫升样品中含有的细菌群落总数）第五十页，共五十七页，编辑于2023年，星期四第二章食品微生物鉴定技术和方法第二节食品微生物学的现代鉴定方法4）辐射测定法

利用培养基中14C标记的代谢物为基础，当微生物利用这些物质时，释放14CO2并用放射能计数器检测。

14C标记的葡萄糖。对那些不能利用葡萄糖的微生物，14C标记的甲酸盐或14C标记的谷氨酸盐。第五十一页，共五十七页，编辑于2023年，星期四4）辐射测定法整个程序如下：向15ml带盖的血清瓶中加入12－36ml含标记代谢物的培养基