基因工程预习课件

1.2基因工程的基本

操作程序本文档共42页；当前第1页；编辑于星期六\2点23分本文档共42页；当前第2页；编辑于星期六\2点23分基因工程的目的基因－－

从供体转移到受体的基因，主要指编码蛋白质的结构基因。与生物抗逆性相关的基因与优良品质相关的基因与生物药物和保健品相关的基因与毒物降解相关的基因与工业所需酶相关的基因具有调控作用的因子……本文档共42页；当前第3页；编辑于星期六\2点23分1、获取目的基因的方法有哪些？一、目的基因的获取2、什么叫基因文库，它包括哪些种类？3、用PCR技术扩增基因需要哪些原料？一是从自然界中已有的物种中分离：二是用人工方法合成。现代获取方法：1、从基因文库中获取目的基因2、利用PCR技术扩增目的基因3、化学方法人工合成本文档共42页；当前第4页；编辑于星期六\2点23分基因文库：

将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因文库

基因组文库部分基因文库(CDNA文库)本文档共42页；当前第5页；编辑于星期六\2点23分某生物体内全部DNA

许多DNA片段受体菌群体1、从基因文库中获取目的基因限制酶与运载体连接导入基因组文库某种生物某个时期的mRNAcDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入部分基因文库（cDNA文库）本文档共42页；当前第6页；编辑于星期六\2点23分文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）基因中内含子（具有编码蛋白质序列的非编码DNA片段）物种间的基因交流基因文库两种类型小大无有无有某生物的全部基因基因多少某生物的部分基因可以部分基因可以本文档共42页；当前第7页；编辑于星期六\2点23分

为什么要构建基因文库?直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗?基因文库是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。基因文库可以构建所需的目的基因，并且不含有其他基因。直接从含有目的基因的生物内提取理论上是可以，但是很麻烦；首先取得目的基因后的扩增，转入受体细胞等操作都需要载体,目的基因片段无法确定是否能直接在受体细胞内表达的。一般目的基因都很小，直接提取的话会含有很多其他片段的基因，难以将他们分离开来。问题本文档共42页；当前第8页；编辑于星期六\2点23分依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA

基因翻译产物蛋白质等特性4)从基因文库中得到目的基因的方法本文档共42页；当前第9页；编辑于星期六\2点23分1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的A、染色体DNA

B、线粒体DNAC、总mRNA

D、tRNA2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是A、某生物的全套基因就是一个基因文库B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物体内，则这个生物就是一个基因文库C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库AC本文档共42页；当前第10页；编辑于星期六\2点23分问题2.什么是内含子？3.什么是启动子？1.什么是编码蛋白质序列？编码蛋白质序列是指在具有遗传效应的DNA片段内，具有能通过转录和翻译形成一定的氨基酸序列的脱氧核糖核苷酸序列。本文档共42页；当前第11页；编辑于星期六\2点23分基因a基因b基因c基因d间隔片段：不携带任何遗传信息遗传信息：具有遗传效应的DNA片段内的碱基排列顺序。基因的结构非编码区非编码区编码区本文档共42页；当前第12页；编辑于星期六\2点23分外显子内含子与RNA聚合酶结合位点编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点编码区原核生物基因真核生物基因本文档共42页；当前第13页；编辑于星期六\2点23分1.原核细胞与真核细胞的基因结构的异同点基因原核基因真核基因结构示意图非编码区组成、作用编码区组成、作用转录产物基因功能非编码区非编码区编码区非编码区非编码区编码区外显子内含子内含调控序列，调控遗传信息的表达，调控序列中有与RNA聚合酶结合位点。连续不间隔，编码蛋白分为外显子和内含子，外显子是编码蛋白----间隔成熟的RNA内含子，外显子一起转录为初级转录产物，经加工（剃除内含子转录的部分）成为成熟的RNA①通过复制在亲代与子代之间传递遗传信息②通过转录与翻译表达遗传信息（从而决定生物的性状）。本文档共42页；当前第14页；编辑于星期六\2点23分

真核生物的基因是由基因编码区和非编码组成，编码区内又分为外显子和内含子,只有外显子能编码蛋白质编码区,能转录响应的信使RNA,进而指导蛋白质的合成。非编码区，不能转录为信使RNA,不能编码蛋白质，但具有调控遗传信息表达的核苷酸序列，最重要的是有位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。包括位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点和下游的非编码区。原核生物基因就是编码区和非编码区。原核生物不能编码蛋白质的序列为非编码区，而真核生物则有非编码区和编码区内的内含子。所以真核细胞的基因具有间隔性、不连续性，是因为包括：编码区内的外显子、不能编码蛋白质的序列内含子以及非编码区。2.什么是内含子本文档共42页；当前第15页；编辑于星期六\2点23分启动子位于DNA上，属于基因非编码区上游的核苷酸序列。启动子上有与RNA聚合酶结合点。只有在启动子存在时，RNA聚合酶才能准确地识别转录起点，并沿着DNA编码区正常地进行转录。3.什么是启动子？启动子与起始密码的区别：内含子没有遗传效应，起始密码位于mRNA上，只有两种：AUG和GUG，既决定一种氨基酸，同时做肽链合成的启动信号。终止子与终止码同理。二者对于基因而言的，编码的部分为外显子，不编码的为内含子。本文档共42页；当前第16页；编辑于星期六\2点23分

2.利用PCR技术扩增目的基因

称多聚酶链式反应穆里斯等人于1988年发明的。PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。本文档共42页；当前第17页；编辑于星期六\2点23分①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：_______________________、

_______________、___________、___________.②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）多聚酶链式反应体外特定DNA片段已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸引物DNA聚合酶指数2nDNA复制本文档共42页；当前第18页；编辑于星期六\2点23分高温变性中温延伸低温复性PCR本文档共42页；当前第19页；编辑于星期六\2点23分在TaqDNA聚合酶的作用下，以四种脱氧核苷酸为原料，进行延伸，合成与模板互补的DNA链。⑤反应过程：a.变性(90～95℃):b.复性（退火）(55～60℃):c.延伸(70～75℃):DNA模板解链引物与模板结合，形成局部双链d.多次重复本文档共42页；当前第20页；编辑于星期六\2点23分PCR技术与体内DNA复制的区别：1.PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要；2.PCR需要耐热的DNA聚合酶（常TaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；3.PCR一般要经历三十多次循环，而生物体内DNA复制受生物体遗传物质的控制。

4.PCR不需要ATP,体内DNA复制需要；本文档共42页；当前第21页；编辑于星期六\2点23分PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增本文档共42页；当前第22页；编辑于星期六\2点23分细胞内复制

.VS.PCR扩增DNA母链4种

脱氧核苷酸DNA聚合酶（Taq酶）引物（2个）温度控制1）模板：2）原料：3）酶：DNA母链4种脱氧核苷酸解旋酶DNA聚合酶

DNA增殖4）特点:半保留复制边解旋边复制半保留复制全解旋再复制本文档共42页；当前第23页；编辑于星期六\2点23分反转录法目的基因的信使RNA目的基因化学合成法肽链氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成推测推测单链DNA合成3.人工合成—化学合成法基因较小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成仪人工合成本文档共42页；当前第24页；编辑于星期六\2点23分？基因表达载体包括哪些必需组分？各组分有什么作用？二.基因表达载体的构建本文档共42页；当前第25页；编辑于星期六\2点23分基因表达载体的模式图基因表达除含有目的基因外，还需要以下元件：启动子终止子标记基因本文档共42页；当前第26页；编辑于星期六\2点23分基因表达载体的构建过程质粒DNA分子限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个黏性末端本文档共42页；当前第27页；编辑于星期六\2点23分①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意本文档共42页；当前第28页；编辑于星期六\2点23分启动(终止)转录启动(终止)翻译作用位于DNA上位于mRNA上位置DNA片段三个相邻碱基本质启动(终止)子启始(终止)密码子本文档共42页；当前第29页；编辑于星期六\2点23分？什么是转化？将目的基因导入植物、动物、微生物细胞的方法分别有哪些？三.将目的基因导入受体细胞本文档共42页；当前第30页；编辑于星期六\2点23分转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。常用的受体细胞：

有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。本文档共42页；当前第31页；编辑于星期六\2点23分将目的基因导入受体细胞的方法农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射技术感受态法受体细胞植物细胞动物细胞原核细胞本文档共42页；当前第32页；编辑于星期六\2点23分1.将目的基因导入植物细胞----农杆菌转化法本文档共42页；当前第33页；编辑于星期六\2点23分适用于单子叶植物基因枪法本文档共42页；当前第34页；编辑于星期六\2点23分胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊本文档共42页；当前第35页；编辑于星期六\2点23分花粉管通道法适用于被子植物本文档共42页；当前第36页；编辑于星期六\2点23分三、将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞转化农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法2.将目的基因导入动物细胞提纯基因表达载体体外显微注射入受精卵受精卵移植显微注射技术本文档共42页；当前第37页；编辑于星期六\2点23分三、将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞转化农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法2.将目的基因导入动物细胞显微注射技术3.将目的基因导入微生物细胞Ca2+处理法本文档共42页；当前第38页；编辑于星期六\2点23分

四、目的基因的检测与鉴定导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？不一定，需要检测本文档共42页；当前第39页；编辑于星期六\2点23分1、鉴定——分子水平的鉴定转基因生物的DNA探针15N15N（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因基因探针：指用荧光或放射性同位素标记的DNA分子方法——DNA分子杂交技术变性变性本