动物细胞融合和单克隆抗体

“太空婚礼”

2002年１２月３０日，

两场筹备了10年的“太空婚礼”首次在神舟四号飞船上举行，植物细胞“新人”—黄花烟草和革新一号烟草叶肉细胞原生质体，动物细胞“新人”是小鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞，两批新人同时在“产房”—电融合仪内孕育新生命。一段时间后，我国首批”太空娃娃”终于顺利诞生。对照实验结果表明，细胞融合率大大提高。本文档共35页；当前第1页；编辑于星期六\0点7分挑战自我“太空婚礼”科研项目一：植物体细胞杂交技术“太空婚礼”科研项目二：

动物细胞融合技术本文档共35页；当前第2页；编辑于星期六\0点7分温故而知新：哪种植物细胞工程技术可以突破不同生物之间的生殖隔离，克服远缘杂交不亲和的障碍，培育出新的作物类型？

植物体细胞杂交技术你能回忆出植物体细胞杂交的过程吗？本文档共35页；当前第3页；编辑于星期六\0点7分植物细胞A植物细胞B去掉细胞壁去掉细胞壁原生质体A原生质体B原生质体融合杂合的原生质体再生出细胞壁杂种细胞脱分化再分化愈伤组织胚状体/杂种植株温故知新:植物体细胞杂交过程本文档共35页；当前第4页；编辑于星期六\0点7分动物细胞融合本文档共35页；当前第5页；编辑于星期六\0点7分

课前思考1、什么叫动物细胞融合？植物体细胞杂交技术与动物细胞融合有什么不同呢？2、动、植物细胞在结构上有何区别？这与它们杂交或融合过程有什么影响？3、动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理是否相同？两者的融合过程是否也一样？4、植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些？那动物细胞融合呢？本文档共35页；当前第6页；编辑于星期六\0点7分动物细胞融合和单克隆抗体细胞融合是正常的生命活动正在融合的两个细胞受精作用本文档共35页；当前第7页；编辑于星期六\0点7分一、动物细胞融合1.概念：两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程2.原理：细胞膜的流动性本文档共35页；当前第8页；编辑于星期六\0点7分诱导方式物理法化学法生物法：灭活的病毒仙台病毒紫外线丧失感染性（不感染细胞）保留融合活性（诱导细胞融合）3、诱导方法灭活：指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏这些病原体的抗原结构本文档共35页；当前第9页；编辑于星期六\0点7分4.过程：融合有丝分裂杂交细胞含不同DNA的两个细胞本文档共35页；当前第10页；编辑于星期六\0点7分过程详解灭活的病毒诱导细胞融合的原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。本文档共35页；当前第11页；编辑于星期六\0点7分5、动物细胞融合技术的意义和应用本文档共35页；当前第12页；编辑于星期六\0点7分思考题①.植物体细胞杂交时首先应用什么方法去掉细胞壁？酶解法，如纤维素酶,果胶酶②.动物细胞融合时需要进行去壁处理吗？为什么？无需，因为动物细胞无细胞壁

③.植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些？离心、电激等物理方法；PEG等化学方法

④.动物细胞融合能利用上述两类方法吗？还有其他方法吗？能还可以利用灭活的病毒进行诱导

⑤.植物体细胞杂交应先进行原生质体的融合再进行组织培养形成完整的杂种个体，动物细胞融合后能形成杂种动物个体吗？不能本文档共35页；当前第13页；编辑于星期六\0点7分细胞融合与诱导细胞融合物质：诱导剂：仙台病毒、聚乙二醇

诱导细胞融合的病毒必须灭活。

思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？不灭活行吗？因为不灭活的病毒会感染细胞，而不能诱导细胞融合。本文档共35页；当前第14页；编辑于星期六\0点7分植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合过程原理细胞融合的过程诱导方法用途细胞膜的流动性、细胞的全能性细胞膜的流动性去除细胞壁后诱导原生质体融合使细胞分散后诱导细胞融合物理、化学方法物理、化学、生物方法获得杂种植株制备单克隆抗体细胞融合，植物组织培养细胞融合本文档共35页；当前第15页；编辑于星期六\0点7分单克隆抗体温故知新本文档共35页；当前第16页；编辑于星期六\0点7分提问？#抗体是由何种细胞产生的？效应B细胞（浆细胞）。#一个Ｂ淋巴细胞(浆细胞)能分泌多种抗体吗？

每一个Ｂ淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。抗体的化学本质是免疫球蛋白。B淋巴细胞与抗体的关系：

１．B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。２．每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。３．动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。4.抗体主要分布于动物血清中，在外分泌液中有少量抗体。本文档共35页；当前第17页；编辑于星期六\0点7分一、生产抗体的传统方法效应B细胞多种抗原动物体内刺激抗体抗原不纯抗体不纯筛选单一效应B细胞效应B细胞不能大量增殖产生大量抗体本文档共35页；当前第18页；编辑于星期六\0点7分

所以传统的抗体的生产方法及缺陷是什么？怎样解决这个问题？特异性差、纯度低；产量低、反应不够灵敏本文档共35页；当前第19页；编辑于星期六\0点7分二、单克隆抗体1.概念：

由单个B淋巴细胞经过克隆形成的基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体特异性强、灵敏度高化学性质单一2.特点：本文档共35页；当前第20页；编辑于星期六\0点7分3、生产单克隆抗体所用细胞及其特点本文档共35页；当前第21页；编辑于星期六\0点7分接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，在体液免疫中具有重要功能。B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡——短命细胞B淋巴细胞所以B淋巴细胞在体外培养时不能无限增殖，而癌细胞是可以无限增殖的。本文档共35页；当前第22页；编辑于星期六\0点7分骨髓瘤细胞:恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可永远分裂和存活——长命细胞。经筛选与驯化，现已建立多种骨髓瘤细胞株——没有抗体分泌物。因此可以利用小鼠骨髓瘤细胞与之融合，就可获得既能无限增殖又能产生单一抗体的细胞。本文档共35页；当前第23页；编辑于星期六\0点7分如何大量生产单克隆抗体？利用淋巴细胞产生抗体的功能利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞如何筛选？融合方式？本文档共35页；当前第24页；编辑于星期六\0点7分设计方案：一个效应B淋巴细胞－－只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞－－能无限增殖杂种细胞本文档共35页；当前第25页；编辑于星期六\0点7分

4.单克隆抗体制备过程

注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选杂交瘤细胞细胞培养筛选，继续培养足够数量的、能产生特定抗体的细胞群体外培养注射到小鼠腹腔单克隆抗体本文档共35页；当前第26页；编辑于星期六\0点7分HAT培养基（属于选择性培养基，含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)）中进行选择性培养，由于氨基蝶呤可阻碍DNA正常合成途径，所以培养基中含有它时，细胞只能通过补救途径合成DNA。未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存本文档共35页；当前第27页；编辑于星期六\0点7分单克隆抗体大量制备过程（杂交瘤技术）过程：本文档共35页；当前第28页；编辑于星期六\0点7分

①利用淋巴细胞产生单一抗体特性②利用肿瘤细胞无限增殖的特性③利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞④利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞思考5、单克隆抗体生产利用了哪些原理和技术？原理技术本文档共35页；当前第29页；编辑于星期六\0点7分1、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体本文档共35页；当前第30页；编辑于星期六\0点7分2、整个制备过程为何要经过两次筛选?（第一次筛选得到杂交瘤细胞（多种），“第二次”需先在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始培养，然后再筛选出能产生特异性抗体的细胞群。由于该细胞群是单个杂交瘤细胞克隆得来的，所以产生的抗体必然是化学性质单一的，特异性强的单克隆抗体。这里的单克隆确有单个细胞克隆的含义，只不过克隆的不是B淋巴细胞，而是杂交瘤细胞。）

本文档共35页；当前第31页；编辑于星期六\0点7分6.单克隆抗体的应用①、作为诊断试剂——单克隆抗体最广泛的用途②、用于治疗疾病和运载药物目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”治疗肿瘤本文档共35页；当前第32页；编辑于星期六\0点7分小结两个过程动物细胞培养过程单克隆抗体制备过程三个“一”一个诱导细胞融合的新方法－－灭活病毒一个新细胞－－杂交瘤细胞一个优势－－单克隆抗体特异性强、灵敏度高的优势本文档共35页；当前第33页；编辑于星期六\0点7分1、科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是（）