人正常食管黏膜上皮细胞的纯化分离和传代培养

人正常食管黏膜上皮细胞的纯化分离和传代培养【摘要】目的：探讨新的食管黏膜细胞的培养方法，以便能够获得大量细胞.方法：采用中性蛋白酶和胰酶先后消化从食管黏膜上分离上皮细胞，比较细胞在无血清培养基和含100ml/L胎牛血清的培养基中的细胞生长曲线和贴壁性；采用细胞角蛋白14、13(CK14,CK13)和波形丝蛋白抗体三者共同鉴定细胞.结果：细胞倍增时间在KSFM中为h(n=3)，而在含100ml/L血清培养基中不能计算；在KSFM中，贴壁细胞明显为高；CK14阳性细胞百分率KSFM组在不同时段均高，但两组内均随生长时间增加而减少；CK13阳性细胞则恰与其相反；两组中均未见波形丝蛋白阳性表达.结论：Dispase消化分离细胞，KSFM作为培养基是食管鳞状上皮可靠的新培养方法.

【关键词】食管；上皮细胞；细胞培养

0引言

目前食管黏膜的传代培养，就报道的极少的几种方法还存在着很多问题，比如大量的成纤维细胞污染［1］，不能传代扩增或传代次数较少［2］，细胞数量较少.我们通过改善原代取材时消化方法，进行含血清及不含血清培养基比较研究，探讨出能获得大量细胞的新的正常食管黏膜细胞的培养方法.

1材料和方法1材料

人角朊细胞培养液，胰酶,DMEM(Hyclone),Dispase(Gibco)，胎牛血清.SP免疫组化染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，单可隆抗体细胞角蛋白14、13和波形丝蛋白(vimentin)抗体购自上海长岛生物有限公司.从3例新鲜食管手术标本上选取正常黏膜标本，浸入4℃PBS中，当日即进行原代培养.标本获取均经患者同意，并签订同意书.

方法

将食管黏膜组织放入添加20万u/L青霉素、200mg/L链霉素和g/L庆大霉素的PBS中充分洗涤到无血迹后，洗必泰消毒，后依次采用如下方法消化分离获取黏膜细胞.4℃条件下标本在g/L中性蛋白酶中消化18~24h后，用眼科镊将黏膜层撕下，放入g/L胰酶中，37℃消化5～10min.其后加入等量的含100mL/L胎牛血清的DMEM终止消化，吹打，成单细胞液，离心，PBS清洗后接种.静置于37℃，50mL/LCO2培养箱中，24~48h后观察细胞贴壁情况，弃取原培养基，其中含未贴壁细胞，加入新鲜培养基后继续培养.上皮细胞铺满培养皿底的75%，加EDTA的g/L胰酶消化后可传代.设无血清培和含血清两种培养基进行对照观察［3,4］.无血清者成分为：KSFM，每500mL含mL牛垂体提取物,gL谷氨酰胺,3μL生长因子;含血清者在前者的基础上加入100mL/L胎牛血清，其余成分相同.余实验方法和实验条件相同.为结果有可比性，本实验中接种细胞均为在KSFM中生长的细胞.选取第2代细胞，24孔板接种，观察7d，绘制两种培养基中细胞的生长曲线.按最适密度接种，计算两组原代接种后48h，第1代接种后24h贴壁细胞数.选取KSFM中为计算生长曲线而消化下的细胞，以1×104个/cm2重新接种，培养基为KSFM，24h后将已经贴壁的细胞胰酶消化，并计数.计算贴壁细胞百分比，观察不同生长时段细胞的贴壁能力.细胞生长在载玻片上,用650mL/L冷丙酮固定20min,细胞免疫组化法检测两不同培养基组第2代接种后1,3,5,7d的细胞CK14,CK13及波形丝蛋白的表达情况.实验步骤中不加一抗改加PBS为空白对照.采用如下方法进行半定量比较：在显微镜下，计算相邻20个视野内的阳性细胞，计算阳性细胞百分率.

统计学处理：运用t检验、方差分析对结果进行统计学分析.

2结果

食管黏膜上皮细胞的特性食管黏膜细胞原代接种于培养瓶中，均从4~6h开始出现细胞贴壁生长，此过程多持续48h以上.贴壁细胞变成卵圆形，有突起形成，边界不清楚,并且细胞胞质透亮.其后即出现分裂增殖.原代培养的上皮细胞最适接种密度×104个/cm2，传代培养的最低接种密度［5］大于1×103个/cm2才能形成克隆，最适接种密度为×104个/cm2.选择最适的接种密度，细胞于4~5d进入生长平坦期，生长至培养瓶的70%~80%，需要传代.无血清培养基组，细胞呈卵圆形，单层生长，呈铺路石样；第1~5代，细胞大小均一，呈卵原形，第5~6代以后，出现巨型细胞及长梭形细胞，占3%~5%，后随传代数增加巨型细胞增加.本实验已传代达15代，细胞仍具有较好状态，80%细胞胞质透亮，形态呈卵圆形，后未再继续传代培养.血清培养基组，细胞成多角形，出现复层上皮.消化后的细胞成团块状及细胞片较多，并且不易吹打散开.血清培养基组仅培养3代，由于传代后贴壁细胞数迅速递减，而不能继续增殖传代.两组从原代培养到以后的各代均未发现有成纤维细胞生长.

细胞生长曲线接种密度为×104个/cm2时，KSFM中细胞群体倍增时间(PDT)为(±)h(n=3).但含血清组细胞增殖缓慢，由于传代后帖壁细胞数迅速递减而不能计算PDT.生长曲线见Fig1.

细胞贴壁性在KSFM中原代和第1代细胞种植24h后贴壁细胞数与接种细胞数之比分别为(75±8)%和(105±4)%，在含血清培养基组中分别为(37±15)%和(56±8)%(n=3),两组对照，有显着性差异.接种1d,胰酶消化时间约为min,后随着接种生长时间的延长消化时间即延长，接种7d，消化时间为(10~15)min.无血清组不同生长天数细胞经消化后，重新接种，

其贴壁情况见Fig2，不同时段贴壁细胞百分数之间存在显着差异，以d3,4消化后重新接种后贴壁细胞百分数较高.

免疫细胞化学染色细胞爬片染色后，两不同培养基组爬片中均见到CK14和CK13阳性细胞，而未见到波形丝蛋白阳性细胞.无血清培养基组于d1,3,5,7的CK14阳性细胞百分率均较同时间对照的含血清培养基组为高，(其中d3,5,7有统计学差异，)；并两组内阳性细胞百分率随生长时间增加而减少；而CK13阳性细胞百分率的波动恰于其相反(Fig4).

3讨论

我们通过改变原代取材时的消化酶，通过不同培养基间的比较，从而使食管黏膜上皮的原代及传代培养均获成功，并克服成纤维细胞污染，不能传代扩增或传代次数较少，细胞数量较少等问题.黏膜上皮细胞培养关键的一步是上皮细胞与成纤维细胞的分离，有效的分离可避免成纤维细胞的污染.Dispase是一种中性蛋白酶，用于人皮肤表皮细胞的培养中，其作用于表皮与真皮结合处，破坏半桥粒结构，使基底细胞层底部完整分离［5］.从本实验可见，dispase亦可成功地将食管黏膜层中的上皮层和固有层分离开，所获的上皮层再经胰酶消化后，就得到了不含成纤维细胞的黏膜上皮细胞，达到了细胞的纯化.抗波形丝蛋白mAb组化反应阴性，也说明了分离培养的食管黏膜细胞中无其他类型细胞的掺杂污染.

食管黏膜上皮细胞在添加了100mL/LFBS的KSFM中贴壁和扩增能力均较在单纯KSFM为低.角蛋白是上皮细胞的骨架蛋白，CK14仅表达于基底层细胞［6］，CK13是食管上皮复层分化相关标记，仅表达于基底层上细胞的胞质中.结果见含血清培养基组中基底层细胞比例明显较低，基底层上细胞数量增加，并可改变上皮细胞单层生长的状态，促进部分细胞呈复层生长，说明血清明显促进细胞分化.正因此，血清影响了细胞大量扩增，不利于食管黏膜上皮多次传代培养.在KSFM中，由于接触抑制，接种后5d，细胞即进入生长停滞期，分化细胞亦突然明显增加，细胞趋于老化.不同生长时期的细胞消化后再接种，其贴壁性能亦不同.在传代接种中，基底层细胞具有较强贴壁性，分化细胞贴壁性较低,分化细胞不能传代,我们探讨出一种培养食管黏膜鳞状复层上皮的新方法.分化细胞如何培养，如何诱导或控制细胞分化等尚需要进一步研究.

【参考文献】

［1］CorinnaPW,MichaelTB,PatriciaCG,etal.GeneticanalysisoflongtermBarrettsesophagusepitheliacultureexhibitingcytogeneticandploidyabnormalities［J］.Gastroenterology,1998;114(2):295-304.

［2］GarewalHS,LeibovitzA,SamplinerRE,etal.Tissuecultureofepithelialcellsfromesophagealspecializedcolumnarepithelium(Barrettsesophagus)［J］.DigestiveDiseasesandSciences,1992;37(4):532-536.

［3］RebaccaCF,MichaelJG,GeorgeT.NoveladaptationofbrushcytologytechniqueforshorttermprimarycultureofsquamousandBarrettsesophagealcells［J］.GastrointestinalEndoscopy,2001;54(2):186-189.

［4］HarvimaIT,LappalainenK,HirvonenMR,etal.HeparinmodulatesthegrowthandadherenceandaugmentsthegrowthinhibitoryactionofTNFalphaonculturedhumankeratinocytes［J］.JCellBiochem,2004;92(2):372-386.

［5］GermainL,RouabhiaM,GuignardR,etal.Improvem