分子克隆及蛋白表达常见问题和对策

分子克隆及蛋白表达常见问题和对策一、重要意义与应用（一）重要意义分子克隆技术起步于上世纪70年代

1、开辟了分子生物学研究的新领域；2、打开了人类了解、识别、分离和改造基

因，创造新物种的大门；3、对工业、农牧和医药业产生深远影响；4、将为解决世界面临的能源、食品和环保

三大危机开拓新的出路。一、重要意义与应用分子克隆技术基因工程细胞工程酶工程发酵工程紧密联系、综合利用（二）在工业生产中的应用一、重要意义与应用

利用分子克隆技术生产的化学试剂：

丙烯酸、己二酸、乙二醇、甲醇、环氧乙烷、乌头酸和水杨酸等。

污水处理：

利用基因操作，将某种微生物的基因转入另一微生物，创造对有害物质降解能力更强的新菌种，以分解污水中的有毒物质。食品工业：

利用细菌可生产蛋白质、氨基酸和糖等。一、重要意义与应用

（三）在制药工业中应用利用分子克隆和发酵技术已工业化生产重组蛋白药物及相关产品：胰岛素、人牛鸡的生长激素、人干扰素、松弛素、促红细胞生长激素、乙肝病毒抗原和口蹄疫病毒抗原等。利用分子克隆技术还可提高微生物本身所产生的蛋白和抗生素类药物的产量。一、重要意义与应用

（四）在基因治疗中的应用

通过基因水平的操纵而治疗或预防疾病。

基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活

1990年，NIH进行了世界上首例基因治疗临床试验

修复了一个复合免疫缺陷综合征女孩腺苷脱氨酶的活性，使其免疫系统得到了恢复。

2012年，首个基因治疗产品获批上市

欧洲药品管理局批准荷兰生物技术公司UniQure以重组腺相关病毒(AAV)为载体的基因治疗药物Glybera上市，用于脂蛋白脂酶缺乏症(LPLD)患者的治疗。一、重要意义与应用

（五）在农业生产中的应用许多外源基因导入植物的研究获得成功。培育新品种

、作物品质改良、促进作物增产、防除杂草、防治病虫害、抗病菌

等。影响植物基因工程在农业中应用的因素：1、对人体的安全性问题

2、转基因DNA在作物生长中转移或漂移至其他作物，从而引发环境及生态问题3、转基因作物在农产品贸易中的问题一、重要意义与应用

（六）在基因功能研究中的应用

1982年，《MolecularCloning:ALaboratoryManual》由ColdSpringHarborLaboratoryPress出版，这部著作在20年中成为指导生命科学研究的一部“圣经”。

分子生物学技术目前已经是几乎所有主流实验室的必备技术，其中基因克隆技术作为基础和首要技术，是大部分科研同行接触到的第一种分子生物学技术。

一、重要意义与应用

基因过表达、RNAi、基因敲除、基因的定点突变、CRISPR/Cas9等技术已在生命科学研究中广泛应用，没有掌握分子克隆技术科研将寸步难行。二、基因克隆（一）分子克隆技术的诞生

1972年11月，在檀香山有关质粒的会议上首次出现基因克隆技术的想法。

StanleyCohen

（1986年诺奖获得者），对HerbertW.Boyer

关于细菌酶切割DNA分子特定部分的介绍很感兴趣。在威基基的一间熟食店里，两位科学家相遇，构思出了一个开创现代生物技术产业的实验。

1973年初，他们推出了一系列实验，以选择特定的外源基因在细菌中复制。二、基因克隆

（二）什么是基因

基因是细胞内DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。

基因控制蛋白质合成，是不同物种以及同一物种的不同个体表现出不同的性状的根本原因。

"种瓜得瓜，种豆得豆"，"一母生九子，九子各不同"。

基因通过DNA复制及细胞分裂把遗传信息传递给下一代，并通过控制蛋白质的合成使遗传信息得到表达。二、基因克隆

（三）基因克隆的概念基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的生物技术，最终目的在于通过相应技术手段，将目的基因导入宿主细胞，在宿主细胞内目的基因被大量的复制。该技术可概括为∶分、切、连、转、选。二、基因克隆切：用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，即切出目的基因；连：用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA相连接，形成重组DNA分子；转：将重组DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；

选：从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。二、基因克隆基因工程技术的两个最基本的特点：1、分子水平上的操作2、细胞水平上的表达

分子水平上的操作即是体外重组的过程，是利用工具酶对DNA分子进行“外科手术"。基因克隆技术又称为分子克隆、基因的无性繁殖、基因操作、重组DNA技术以及基因工程等。二、基因克隆（三）最初的基因克隆实验1972年，斯坦福大学的P.Berg等人将一种猿猴病毒的DNA与λ噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子相连接，产生了一种新的重组DNA分子，奠定了基因克隆技术的基础。1973年，S.Cohen等人把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一次完整地建立了基因克隆体系。二、基因克隆（四）基因克隆的基本过程基因克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等等。三、克隆过程概述

（一）目的DNA片段的获得

基因克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群DNA分子。

DNA分子的来源：1、目的生物基因组；2、目的细胞mRNA逆转录合成的双链cDNA分子。三、克隆过程概述

基因组DNA较大，不利于克隆，需将其处理成适合克隆的DNA小片段。常用的方法：机械切割和核酸限制性内切酶消化若基因序列已知且较小可直接合成。若基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组DNA或cDNA中通过PCR技术可以获得目的基因。三、克隆过程概述（二）载体的选择基因工程的载体的性质：1、在宿主细胞中有独立复制和表达的能力，能使外源重组的DNA片段得以扩增；2、分子量尽可能小，在宿主细胞中有较多的拷贝，便于结合更大的外源DNA片段，并在实验操作中不易被机械剪切破坏；3）最好具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性标记基因），以赋予宿主细胞不同的表型（如对抗生素的抗性）。三、克隆过程概述4、具有尽可能多的限制酶单一切点，为避免外源DNA片段中限制酶位点的干扰提供更大的选择范围。

若载体上的单一酶切位点是位于检测表型的标记基因之内可造成插入效应，则更有利于重组子的筛选。

三、克隆过程概述DNA克隆常用的载体：质粒载体（plasmid），噬菌体载体（phage），科斯质粒载体（cosimid），单链DNA噬菌体载体（ssDNAphage），噬粒载体（phagemid）、酵母人工染色体（YAC）等。

根据载体的使用目的，载体可以分为克隆载体，表达载体，测序载体，穿梭载体等。三、克隆过程概述（三）体外重组

将目的片断和载体分子连接的过程。大多数核酸限制性内切酶能够切割DNA分子形成有黏性末端，用同一种酶或同尾酶切割适当载体的多克隆位点便可获得相同的黏性末端，通过T4DNA连接酶的作用便可形成重组体，此为黏末端连接。

当目的DNA片断为平端，可以直接与带有平端载体相连，此为平末端连接，连接效率差些。三、克隆过程概述有时为了不同的克隆目的，如将平端DNA分子插入到带有黏末端的表达载体实现表达时，则要将平端DNA分子通过一些修饰，如同聚物加尾，加衔接物或人工接头，PCR法引入酶切位点等，可以获得相应的黏末端，然后进行连接，此为修饰黏末端连接。三、克隆过程概述（四）导入受体细胞

载体DNA分子上具有能被原核宿主细胞识别的复制起始位点，因此可以在原核细胞如大肠杆菌中复制，重组载体中的目的基因随同载体一起被扩增，最终获得大量同一的重组DNA分子。三、克隆过程概述将外源重组DNA分子导入原核宿主细胞的方法有转化（transformation），转染（transfection），转导（transduction）。重组质粒通过转化技术可以导入到宿主细胞中，同样重组噬菌体DNA可以通过转染技术导入。转染效率不高，因此将重组噬菌体DNA或柯斯质粒体外包装成有浸染性的噬菌体颗粒，借助这些噬菌体颗粒将重组DNA分子导入到宿主细胞转导技术，该转导技术的导入效率要比转染的导入效率高。三、克隆过程概述（四）重组子的筛选从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即阳性克隆的过程就是筛选。发展起来的成熟筛选方法如下：

1、插入失活法

外源DNA片段插入到位于筛选标记基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位点后，会造成标记基因失活，表现出转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变，通过这些可以初步鉴定出转化子是重组子或非重组子。常用的是β-半乳糖苷酶显色法即蓝白筛选法（白色菌落是重组质粒）。三、克隆过程概述

2、PCR筛选和限制酶酶切法提取转化子中的重组DNA分子作模板，根据目的基因已知的两端序列设计特异引物，通过PCR技术筛选阳性克隆。PCR法筛选出的阳性克隆，用限制性内切酶酶切法进一步鉴定插入片段的大小。注意：

菌落PCR技术筛选阳性克隆时，如果克隆的基因本身来源于宿主的话，不能采用该技术三、克隆过程概述

3、核酸分子杂交法

制备目的基因特异的核酸探针，通过核酸分子杂交法从众多的转化子中筛选目的克隆。目的基因特异的核酸探针可以是已获得的部分目的基因片段,或目的基因表达蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物种的同源基因。注意：

该方法筛选阳性克隆时，如果克隆的基因本身来源于宿主的话，不能采用该技术三、克隆过程概述

4、免疫学筛选法

获得目的基因表达的蛋白抗体，就可以采用免疫学筛选法获得目的基因克隆。注意：上述方法获得的阳性克隆最后要进行测序分析，以最终确认目的基因。四、克隆的要素（一）质粒四、克隆的质粒要素（一）特点：环状DNA分子能够自我复制,或整合到染色体上,随染色体复制.(最重要一点,可自我复制)；有多个限制酶切点(便于切割)；

有标记基因(便于进行检验和筛选)；

有可诱导的启动子(便于基因的诱导表达)。

四、克隆的质粒要素质粒类型：类型有天然质粒；人工构建质粒。按基因工程构建方式可分为:插入失活型质粒；表达型质粒；按拷贝数可分为:高拷贝；低拷贝数质粒四、克隆的其它要素

（二）PCR引物的设计用软件来设计，既要考虑发夹结构，又要考虑二聚体，还要考虑Tm值，显得特别复杂。

首先保证你要的基因是正确的，这个可以从NCBI中找到，大部分是没问题；

然后再找到起始密码子，从那开始大概上游取20-27bp，加上酶切位点，加上保护碱基（一般3个）就是上游引物，取后20-27bp碱基，反向互补，加上酶切位点和保护碱基组成下游引物。这样引物设计就完成了，再放到软件里看看GC含量，Tm值，发夹结构，二聚体等，适当调整碱基个数和保护碱基的个数。需要额外注意的是移码问题。

四、克隆的其它要素设计引物时一定要考虑切点的甲基化问题。涉及到dam甲基化和dcm甲基化。常用的大肠杆菌都有这两种甲基化酶。dam甲基化酶识别GATC位点并甲基化；dcm甲基化酶识别CCWGG位点（W是A或T）并甲基化。有这两种位点那么多数情况内切酶是切不开了。

容易受甲基化影响的内切酶有：Dpn1（GA/TC）天生就甲基化；Cla1（ATC/GAT）如果前面加个G或后面加个C就会发生dam甲基化；Xba1（T/CTAGA）如果前面加个GA或后面加个TC也是dam甲基化，等等有好多。设计引物时一定要注意，避免引入甲基化位点。如果真是避免不了或者后来才发现问题，那么把甲基化的质粒转化到甲基化酶缺陷型大肠杆菌中再提质粒就没有甲基化，可以进行酶切。甲基化缺陷型菌有：DM1（Invitrogen）、INV110（invitrogen）、JM110等。

四、克隆的要素

（三）酶切两种方式：一种纯化后直接酶切连接；一种连T载体再往下切连接。新手建议第二种方法，连T载体。因为PCR产物直接酶切有两个缺点：①由于两头把手太短，虽说有保护碱基，但容易切不好；②无法从电泳上看出切的情况，因为切下了几个或十几个bp，无法验证。

连T载体的优点：①进载体后，大提一次的质粒足够进行下面的克隆了，不再需要总PCR调基因，PCR带来的突变频率高。②酶切会很清晰，切下来了就是有带，没切动就是没有。连T载体也有些麻烦的地方，如需要的切点有时跟T载体上自带的切点冲突，这就要鉴别；而且连T载体最好测序看一下PCR的产物对不对、切点对不对。

四、克隆的其它要素有时手工小提或粗提的质粒酶切效果不好，这可能是提取的不够纯或者内切酶品质不好。建议用柱子精提或大提。

四、克隆的其它要素

酶切需注意如下几点：

①如果是双酶切A和B，预实验中必须做A和B各自的单酶切和A+B的双酶切,好确认这几种酶都好用，质粒上的切点都好用。如果切不开就要考虑是不是酶的问题，buffer的问题，质粒上有没有这些切点，序列是否甲基化等。

②酶切尽量用大体系，如50ul、100ul等。大体系能稀释内切酶包装中的甘油，对反应有利。相反，连接尽量用小体系，以增加DNA末端的碰撞机会。

四、克隆的其它要素

③酶切时用酶量不用太大。大了会切碎，形成一些不规则的末端，不利于下一步连接。

④酶切后的电泳，如果切成的条带很清晰，不拖泥带水，没有弥散，没有拖尾，那做回收、连接效果最好。相反，若有弥散、拖尾、不清楚、一团亮等情况就是切的不好，做后续实验成功率会降低。若真是效果很差建议改进体系重新切。

四、克隆的其它要素

（四）DNA回收回收DNA可以用试剂盒或手工法。柱式回收试剂盒：此类试剂盒适合各种长度DNA，对黏性末端基本没有破坏，回收效率高。手工醇沉法步骤如下，把切得的胶弄碎，用Tris-HCl浸泡一段时间，吸出所有的液体，用酚抽提一遍，氯仿抽提一遍，加盐和醇醇沉，沉淀用70％乙醇漂洗，再用Tris溶解。此方法优点是对DNA和黏性末端的损伤最小，缺点是容易损失DNA。四、克隆的其它要素

回收后要电泳，一来估算回收液浓度，二来看回收DNA的质量。若条带有弥散，即自目的条带以下有拖痕，不是清晰利落的一条带，则质量不好。质量不好的回收产物做连接成功率会降低，假阳性克隆会增加。造成回收质量差的原因可能是回收这步，也可能是酶切出现问题。只有回收到清晰、利索的条带，才不影响连接。

四、克隆的其它要素

（五）感受态

感受态的效率要高。感受态的感受效率一般刚制备完时是最高的，以后逐渐减弱，要求取感受态时动作迅速、最大程度减少感受态盒升温。如果你们的感受态已经储存了很长时间或者连接长的克隆连续几把都太少就要重做感受态了。制备感受态最好由经验丰富者做或他带你做。制备高感受态细菌的方法：采用低温培养（16-18℃），进入对数生长时收菌，制备高感受态细菌（长片段克隆需要）。

四、克隆的其它要素

（六）连接连接的问题讨论的是比较多的。如果前述若干步骤所得产物质量好，连接不会很难。

①DNA的量：DNA总量有几十ng就能连接成。当然如果你的DNA质量好，DNA用量越大连接效率越高。就怕你为了追求DNA数量而降低了质量，那可就得不偿失了。

②vector和insert的比例：如果insert不长（2kb以下）、vector是insert的几倍长，可以用1：3－1：6。如果insert较长（3、4kb以上）、vector和insert长度相似或insert比vector还长，可以用1：1－1：3。短片段的连接相对容易，做的好可以挑到好多正确的克隆。长片段的连接效率较低，阳性克隆率小于10％是很正常的。四、克隆的其它要素③体系体积：通常用20ul都能连上，若连长片段可以压缩成10ul（前提是DNA数量不变）。④T4连接酶：酶选择名牌公司产品，而且连接酶控制着整个分子克隆过程的瓶颈——连接，强烈建议买好的。如果连长片段就加二倍的连接酶。⑤连接时间：过夜就应该足够了。四、克隆的其它要素

⑥连接温度：最适是16℃。有人用4℃连接，也行。

⑦转化：连接的转化不能像转质粒那么随便，要小心翼翼，尽量作到不放弃任何一个菌。一般所用的感受态体积最少是连接体系的5倍。长片段的连接转化时摇菌2小时。四、克隆的其它要素⑧对照：对照很关键，可以反应出很多重要的信息，不要懒，你的连接若是问题不少，就要乖乖的做对照。一般有如下几种对照方式：

⑴转化质粒对照。和连接产物同样抗性质粒、一起转化。这个对照目的是检测转化系统是否有效，即抗生素是否有效、板子是否有效、转化的手法是否正确、以及感受态的效率如何（这需要你每次转化质粒都用相同的手法、用量，看长的菌落数，若明显太少就要怀疑感受态）。四、克隆的其它要素

⑵切完回收的vector直接转化对照。如果你是双酶切，切完的vector和没切的vector的长度相差不大，或跑电泳这两种跑不很开，就要做这个对照。目的是看切的是否彻底，是否还有环状质粒存在。长不出克隆是对的，若长出克隆，好好改进你的酶切体系。

⑶切完回收的vector加连接酶自身连接再转化做对照。双酶切的，最好要做这个对照，这个对照能检测酶切和回收的质量，总之不长克隆或只长很少是对的，长多了还是去改进上游的步骤。

四、克隆的其它要素（七）基因来源问题

对于原核基因，可以通过NCBI网路基因数据库获得全基因序列，设计引物，利用基因组DNA为模板进行PCR获取相关基因；

对于真核基因，情况要复杂得多，虽然我们也能够从基因数据库获得基因序列，但由于模板问题，因此需要首先构建基因文库，或者利用RTPCR方法从真核细胞中获得相关基因。四、克隆的其它要素真核基因获取一、贴壁细胞总RNA提取：1、吸掉培养液，用PBS洗一遍2、往培养皿中加入1ml,TRIzol,吹打几次(每10cm2面积,即3.5cm直径的培养板加1ml)

3、移至1.5mlEP管，静置5分钟

4、加入200ul三氯甲烷，震荡混匀，室温静置5分钟

5、4度12000r/min，离心15分钟，取上清约600ul

6、加入500ul异丙醇，混匀后，静置30分钟四、克隆的其它要素7、4℃12000r/min，离心15分钟，弃上清8、加入1ml70%预冷酒精洗涤沉淀物9、4℃7500r/min，离心5分钟10、弃上清，自然晾干11、加入50ulDEPC水溶解，测OD值

四、克隆的其它要素二、RT体系：20ul：预变性体系12ul

5×buffer

4ul

RNAase

inhibiter

1ul

10m

dNTP

2ul

MMLV逆转录酶

1ul

42℃60min

；70℃

5min

；12℃

forever四、克隆的其它要素三、PCR体系20ul：10×buffer

2ul

10m

dNTP

0.5ul

Primer(F+R)

1ul

（0.5ul+0.5ul）稀释后cDNA（50ul）1ul

Pfu

0.2ul

dd

water

15.3ul

95℃3min、（95℃30s，55℃30s，72℃35s）×29cycle、72℃10min、12℃forever五、基因克隆实例

启动子荧光素酶报告基因的构建和活性检测[实验目的]1.掌握基因克隆方法2.掌握寻找启动子序列的方法；3.掌握用荧光素酶报告基因的方法检测转录因子和启动子之间的结合和激活效应。五、基因克隆实例[实验原理]启动子是参与特定基因转录及其调控的DNA序列，包含核心启动子区域和调控区域。核心启动子区域产生基础水平的转录，调控区域能够对不同的环境条件作出应答，对基因的表达水平做出相应的调节。启动子的范围非常大，可以包含转录起始位点上游2000bp的区域，有些特定基因的转录区内部也存在着转录因子的结合位点，因此也属于启动子范围。五、基因克隆实例

转录起始复合物识别的是启动子序列，而不是整个基因的序列。比如用干扰素处理细胞，所有干扰素作用的靶基因，因为携带有ISRE（interferon-stimulatedresponseelements，干扰素刺激反应元件）的启动子，因此都可以被激活转录。五、基因克隆实例

转录因子蛋白的结构可以分成结合域（BD，bindingdomain）以及激活域（AD，activationdomain）两部分，作为基因启动子DNA的序列也具有特征性的结构。一般情况下，确定了一种新基因的编码区序列之后，通过与htgs数据库的同源性比对，可以很方便地确定其相应的基因组DNA序列。在确定编码基因的起始密码子之后，指导基因表达的启动子序列一般位于其上游基因序列300-3000nt之间，鲜有例外。五、基因克隆实例

因此可以从翻译起始密码子上游的基因组DNA序列，选取3000nt左右的核苷酸序列进行生物信息学分析。例如可以应用在线软件分析技术，或自行研发的启动子序列分析技术等软件分析.五、基因克隆实例

在相应化学反应中，荧光的产生是来自于荧光素酶催化下的萤光素氧化，有些情况下反应体系中也包括三磷酸腺苷（ATP）。荧光生成反应通常分为以下两步：萤光素+ATP→萤光素化腺苷酸（luciferyladenylate）+PPi；萤光素化腺苷酸+O2→氧荧光素+AMP+光（图1）。这一反应非常节省能量，几乎所有输入反应的能量都被转化为光。五、基因克隆实例

图1.荧光素酶催化的发光反应五、基因克隆实例

目前Promega公司开发出了荧光素酶报告基因系列载体（图2），如pGL3及pGL2，它们含SV40启动子及增强子的不同组合，有助于分析DNA片段的转录活性。具体情况如下：pGL2-及pGL3-Basic载体不含启动子及增强子，因此将可能的启动子序列克隆到荧光素酶基因的上游，可测定其是否具有启动荧光素酶基因表达的活性；pGL2-及pGL3-Promoter载体含SV40的启动子，可驱动荧光素酶基因表达，而插入可能的增强子可增加荧光素酶基因的表达；pGL2-及pGL3-Enhancer载体在荧光素酶基因下游插入了SV40的增强子，这可用于测定能增强荧光素酶基因表达的启动子；五、基因克隆实例

pGL2-及pGL3-Control载体含SV40的启动子及增强子，能产生高水平的荧光素酶基因表达，可作为检测转染频率的有效对照。因此，我们可以把目的基因的启动子序列连接到荧光素酶的上游，把报告基因质粒转染进入细胞。如果这段启动子序列确实可以和某个转录因子相结合，而激活下游荧光素酶的转录和翻译，那么当加入底物和ATP时，体系的荧光产生就会增多，从而可以通过检测荧光强度来间接地反映转录因子和启动子之间的结合和激活效应。五、基因克隆实例五、基因克隆实例[仪器、材料与试剂]（一）仪器冷冻台式离心机、水浴锅、PCR仪、化学发光检测仪、DNA凝胶电泳装置（二）材料人肝癌细胞株HepG2、H1299细胞株、DMEM培养液、胎牛血清、pGL3-Basic载体及检测底物、限制性核酸内切酶KpnI和HindIII、T4连接酶、KOD-plusDNA聚合酶、基因组DNA提取试剂盒、小量提取质粒试剂盒、DH5a大肠杆菌感受态细胞、荧光素酶双报告基因检测试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒（三）试剂LB细菌培养液、双蒸水、DNA电泳缓冲液（TAEbuffer）五、基因克隆实例[实验步骤]

第一步：基因组DNA的提取

将贴壁培养的HepG2细胞处理成细胞悬液，按照试剂盒说明提取DNA（离心柱型血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，TiangenDR303），用分光光度计测定产物在260nm处吸收值，以计算其浓度。使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度及完整性。

五、基因克隆实例第二步：Bax启动子的载体构建Bax启动子的PCR扩增和回收纯化：Bax启动子序列为971bp（AB183034）,根据软件Primerpremier5.0设计引物如下：上游引物（其中斜线加粗序列GGTACC为KpnI酶切位点，GG为保护性碱基）:5’-GGGGTACCCCTGCTGATCTATCAGCACAG-3’；下游引物（其中斜线加粗序列AAGCTT为HindIII酶切位点，GG为保护性碱基）：五、基因克隆实例第二步：Bax启动子的载体构建下游引物：5’-GGAAGCTTACCGCCGCTCCCGCCGCCGCCTCT-3’。在PCR反应管中加入：DNA2ml，dNTP（各2.5mM）4ml，10×buffer（无Mg2+）5ml，MgSO4（25mM）3ml，上游引物（10mM）2ml，下游引物（10mM）2ml，ddH2O3m1，KOD-plus1ml（高保真，能扩高GC含量基因的酶KOD-plus）。五、基因克隆实例

PCR反应条件如下：94℃变性3min，然后PCR36个循环，每个循环包括94℃变性30s，60℃退火30s，68℃延伸1min，36个循环结束后，再68℃延伸5min。PCR产物于2%琼脂糖电泳并回收目的产物。pGL3-basic质粒的抽提：采用碱裂解法小量抽提质粒。所得质粒用分光光度计测定浓度后，于1%琼脂糖凝胶电泳。五、基因克隆实例

Bax启动子PCR片段和pGL3-basic质粒的双酶切及回收：将目的promoter回收产物和pGL3-basic质粒分别进行KpnI和HindIII双酶切，酶切条件分别如下：pGL3-basic质粒/promoterDNA：10ml/30ml，KpnI（10U/ml）：2ml，HindIII（10U/ml）：2ml，10×buffer：5ml，ddH2O31ml/11ml，共50ml。37℃酶切过夜，完成后，于1%琼脂糖凝胶电泳，并分别回收酶切后的promoterDNA和pGL3-basic质粒。五、基因克隆实例

连接和转化：将回收的promoterDNA双酶切产物连接到pGL3-basic质粒中，并将此重组的pGL3-basic质粒转化DH5a感受态细胞，获得重组克隆。

分别取promoterDNA双酶切回收产物（68ng/ml）6ml，pGL3-basic质粒双酶切回收产物（160ng/ml）2ml，10×buffer2ml，T4DNAligase（5U/ml，Fermentas）1ml，ddH2O9ml，共20ml。22℃连接2h。将20ml连接产物与100mlDH5a感受态混匀冰上放置30min，42℃90s，冰上5min，然后加入700mlLB培养基（无抗性），于37℃、250r/min摇床上培养1h后，涂于Amp+抗性的固体培养基平板，37℃培养过夜，平板上有克隆长出，挑取一些克隆进行阳性鉴定。五、基因克隆实例

阳性克隆鉴定、测序：挑取10个平板克隆接种于LB（Amp+抗性）培养基中，37℃、220r/min振摇培养直至菌液混浊。各取1ml做PCR克隆鉴定，于2%琼脂糖胶电泳，提取阳性克隆质粒作KpnI和HindIII双酶切鉴定，挑选阳性克隆上海生工公司测序。

五、基因克隆实例

第三步：荧光素酶表达活性测定

分别将pGL3-basic质粒0.8mg和构建的pGL3-basic-Bax-promoter质粒0.8mg转入培养的H1299细胞中，同时转染入0.01mg的pRL-SV40荧光素酶表达质粒作为转染效率内参照，24h后收集转染细胞，制成细胞裂解液，使用Promega公司的双荧光报告基因分析试剂和GloMax2-/20发光检测仪测定荧光值。五、基因克隆实例[实验结果]1.Bax启动子PCR产物于2%琼脂糖电泳并回收目的产物，结果如图1。回收产物采用eppendorfBioPhotometer紫外分光光度计测定浓度为80ng/ml。pGL3-basic质粒抽提后所得质粒于1%琼脂糖凝胶电泳，如图2所示。五、基因克隆实例

Bax启动子PCR产物五、基因克隆实例pGL3-basic质粒电泳图

1：1kbladder；

2，3：pGL3-basic质粒五、基因克隆实例双酶切完成后，于1%琼脂糖凝胶电泳,分别回收酶切后promoterDNA和pGL3-basic质粒五、基因克隆实例阳性克隆鉴定：挑取10个平板克隆，接种于LB（Amp+抗性）培养基中，37℃、220r/min振摇培养直至菌液混浊。各取1ml做PCR克隆鉴定，于2%琼脂糖凝胶电泳，结果如图4，可见有5个克隆均为阳性。提取1、6、8号阳性克隆质粒作KpnI和HindIII双酶切鉴定，酶切结果见图5。挑选阳性克隆于上海生工公司测序，结果证明所构建质粒与设计相符。五、基因克隆实例Bax启动子报告基因转染细胞后荧光素酶表达六、研究生实验过程中

常出现的错误（一）引物设计出现的错误将待克隆的基因进行限制性内切酶位点分析，从质粒中选取两个限制性内切酶，注意，最好采用有粘性末端的酶，切记不要采用一个粘性末端，一个平末端，这样永远都不能成功，引物采用的限制性内切酶在待克隆的基因中不存在该位点。引物设计时，不管是上游还是下游引物，都从5‘端-3’端，因此，限制性内切酶永远是一个顺序，如BamHI，GGATCC上游，下游引物的退火温度要接近，在人为碱基中通过调节GC，或AT的量调节；避免引物二聚体的产生。研究生实验过程中常出现的错误（二）限制性内切酶活性不验证克隆过程中限制性内切酶的验证对克隆的成功与否十分关键，需要通过对质粒的单酶切验证，采用单-单-双的酶切和琼脂糖电泳验证，质粒完全线性化可认为酶活性正常，同时注意酶切缓冲液的适配问题，两种限制性内切酶如果一个高盐，一个低盐，采用中盐缓冲液。六、研究生实验过程中

常出现的错误（三）表达载体中阅读框的错误蛋白诱导表达中我们经常采用融合蛋白表达方式，如果标签序列在N-端，我们要表达的基因的起始密码子ATG必需在阅读框内；如果标签序列在C-端，我们要表达的基因的终止密码子在引物中要去掉。六、研究生实验过程中

常出现的错误（四）用错质粒克隆过程中需要的质粒来源十分重要，经常要从师兄或师姐或从别的实验室获得，要质粒也要从牢靠的人手上获得，否则，2个星期甚至一个月会浪费掉，人也很郁闷，本来完全可以避免。六、研究生实验过程中

常出现的错误（五）用错抗生素实验室中，研究生容易犯得错误是抗生素用错了，导致细菌不能生长。注意：当菌在含抗生素平板上不长时，首先要检查抗生素是否用错。六、研究生实验过程中

常出现的错误（六）限制性内切酶选择错误尽量选择有粘性末端的限制性内切酶，不要选择平末端的限制性内切酶，如EcoRV等，更不要用一个粘性末端的限制性内切酶，另一个平末端的限制性内切酶，如果这样的话，可能一辈子也不能得到你要的结果。如果只能用平末端的限制性内切酶克隆，注意，载体需要进行去磷酸化处理，否则，给自己找麻烦。七、蛋白的诱导表达将测序正确的阳性克隆质粒转入BL-21大肠杆菌中，选取1-2个单克隆在LB或M9培养基上加入相应的抗生素培养，当菌体生长到OD600至0.7左右加入IPTG或其它诱导剂如乳糖等，诱导6-8小时收菌，超声破壁，离心，用未诱导或空载BL-21plus大肠杆菌为对照进行SDS-PAGA电泳。电泳时最好用总菌蛋白、上清蛋白及沉淀蛋白进行比较，确定诱导的蛋白可溶性如何。七、蛋白的诱导表达

真核和原核表达系统比较

体外重组蛋白表达系统主要分为真核表达系统和原核表达系统。其中原核表达系统以大肠杆菌表达为主，也是目前应用最广泛最多的表达系统。真核表达系统分为：哺乳动物细胞表达，酵母表达系统和昆虫表达系统。其中哺乳动物细胞表达又分为哺乳动物细胞瞬时转染表达和稳定细胞系构建，重组抗体生产。酵母系统又分为毕赤酵母表达和酿酒酵母表达。针对真核表达系统来说，哺乳动物细胞和酵母表达较为常用。七、蛋白的诱导表达各种表达系统的优缺点七、蛋白的诱导表达大肠杆菌蛋白诱导表达：将测序正确的阳性克隆质粒转入BL-21plys大肠杆菌中，选取1-2个单克隆在LB或M9培养基上加入相应的抗生素培养，当菌体生长到OD600至0.7左右加入IPTG或其它诱导剂如乳糖等，诱导6-8小时收菌，超声破壁，离心，用未诱导或空载BL-21大肠杆菌为对照进行SDS-PAGA电泳。七、蛋白的诱导表达SDS-PAGA电泳后的胶进行考姆斯亮兰进行染色，对照不出现，而诱导后出现条带且分子量符合预期的视为阳性，诱导成功。然后检查蛋白在上清还是在沉淀中，确定蛋白的可溶性。大肠杆菌蛋白诱导表达可能出现的情况及应对：1、诱导后蛋白不表达2、诱导后蛋白为包含体3、表达的量不高4、大肠杆菌不能生长5、大肠杆菌前面生长良好，后期快速消失七、蛋白的诱导表达1、诱导后蛋白不表达

这种情况经常会出现，最大的可能性是克隆的基因不正确或者基因表达的阅读框不正确，如诱导2-3次后仍然不表达，建议回到测序的结果中再仔细检查，找到原因七、蛋白的诱导表达2、诱导后蛋白为包含体包含体产生的原因有以下两个方面：-基因本身决定了其不溶性（真核基因/膜蛋白）-表达过快，来不及正确折叠对于第一种情况，能改变的不多，采用共表达伴侣蛋白进行改善对于第二种情况，可以通过降低诱导温度，采用温和诱导剂如（乳糖代替IPTG)，加入相关的氨基酸（精氨酸），采用共表达伴侣蛋白效果更佳。七、蛋白的诱导表达3、诱导后蛋白表达的量不高可通过高密度培养，增加细胞量；可通过增加抗生素浓度减少质粒丢失；可通过新型蛋白诱导表达方式，如巴奥得的天达1号，使蛋白（可溶性）表达及细胞量均得到明显提高；天达2号使蛋白（包含体）表达及细胞量均得到大幅提高。七、蛋白的诱导表达

七、蛋白的诱导表达4、大肠杆菌不能生长可能的原因有抗生素用错了或要表达的是有毒基因：

有毒基因影响：宿主中质粒不稳定、抑制菌体生长或溶菌、表达量低或不表达

应对办法：启动子调控、抑制本底表达

选择特殊表达载体PETco-co

选择宿主菌BL-21（DE3）PlysS,BL-21（DE3）PlysE

包涵体表达七、蛋白的诱导表达5、大肠杆菌前面生长良好，后期快速消失可能的原因是受到噬菌体污染：（1）

发酵液光密度上升缓慢，甚至下降，肉眼可见发酵液逐渐变清；（2）

耗糖速度缓慢或停止，产物生成量少或不增加，发酵液中残糖高；（3）产生大量泡末，发酵液呈粘稠状；（4

）菌体不规则，甚至出现畸形。

一旦出现以上情况，立即进行环境消毒，不要抱有幻想

七、蛋白的诱导表达噬菌体污染对策：1

决不使用可疑菌种；2

清除周围环境中存在的噬菌体。能灭菌的灭菌，能消毒的消毒，搞好清洁卫生工作；3

选育抗噬菌体菌株4

轮换使用菌株。因为一个菌株用的时间一长，就有可能出现该菌种的噬菌体。药物防治：

（1）螯合剂。如植酸盐（0.05~1%），柠檬酸盐（0.2~0.5%），草酸盐（0.2~0.5%），三聚磷酸盐（0.5~1%）等可抑制噬菌体的吸附或阻止DNA的注入

七、蛋白的诱导表达药物防治：

（2）表面活性剂。0.01~0.2%的聚乙二醇单酯、聚氧乙烯烷基醚、土温20、土温60等。主要作用于寄主细胞表面，抑制噬菌体在细菌上的吸附。（3）抗菌素。如1ug/mL的金霉素、四环素、氯霉素等抑制噬菌体蛋白质的合成；

（4）

N-脂酰氨基酸。是一类具有16~18个碳原子的衍生物。如20ug/mL的N-棕榈酰-L-谷氨酸，其作用机制是抑制噬菌体核酸的复制或子代噬菌体的成熟

七、蛋白的诱导表达真核基因表达的调控——真核基因表达调控的特点尽管我们现在对真核基因表达调控知道还不多，但与原核生物比较它具有一些明显的特点。真核基因表达调控的环节更多如前所述：基因表达是基因经过转录、翻译、产生有生物活性的蛋白质的整个过程。同原核生物一样，转录依然是真核生物基因表达调控的主要环节。但真核基因转录发生在细胞核（线粒体基因的转录在线粒体内），翻译则多在胞浆，两个过程是分开的，因此其调控增加了更多的环节和复杂性，转录后的调控占有了更多的分量。七、蛋白的诱导表达七、蛋白的诱导表达图中标出了真核细胞在分化过程中会发生基因重排（generearrangement），即胚原性基因组中某些基因会再组合变化形成第二级基因。例如编码完整抗体蛋白的基因是在淋巴细胞分化发育过程中，由原来分开的几百个不同的可变区基因经选择、组合、变化、与恒定区基因一起构成稳定的、为特定的完整抗体蛋白编码的可表达的基因。

这种基因重排使细胞可能利用几百个抗体基因的片段，组合变化而产生能编码达108种不同抗体的基因，其中就有复杂的基因表达调控机理。七、蛋白的诱导表达

此外，真核细胞中还会发生基因扩增（geneamplification），即基因组中的特定段落在某些情况下会复制产生许多拷贝。最早发现的是蛙的成熟卵细胞在受精后的发育程中其rRNA基因（可称为rDNA）可扩增2000倍，以后发现其他动物的卵细胞也有同样的情况，这很显然适合了受精卵其后迅速发育分裂要合成大量蛋白质要求有大量核糖体的需要。基因的扩增无疑能够大幅度提高基因表达产物的量，但这种调控机理至今还不清楚七、蛋白的诱导表达真核基因表达调控和原核生物相比有什么相同点和区别（1）原核生物和真核生物基因表达调控的共同点：

a结构基因均有调控序列；

b表达过程都具有复杂性，表现为多环节；

七、蛋白的诱导表达（2）与原核生物比较，真核生物基因表达调控具有自己的特点：

a真核生物基因表达调控过程更复杂；

b基因及基因组的结构特点不同，如真核生物基因具有内含子结构等；

c转录与翻译的间断性，原核生物转录与翻译同时进行，而真核生物该两过程发生在不同区域，具有间断性；

d转录后加工过程；

e正负调控机制；

fRNA聚合酶种类多。七、蛋白的诱导表达

真核表达系统优点①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制；②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及；③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。

七、蛋白的诱导表达1、酵母表达系统

最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母，后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H

Polymorpha，Candida

Bodini，Pichia

Pastris3种。以Pichia

Pastoris应用最多。甲醇酵母的表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中。大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一1(A0x1)，在该基因的启动子(PAXOI)作用下，外源基因得以表达。PAXOI是一个强启动子，在以葡萄糖或甘油为碳源时。

酵母表达系统甲醇酵母中AOx1基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时PAXOI可被诱导激活，因而外源基因可在其控制下表达,将目的基因多拷贝整合入酵母染色体后可以提高外源蛋白的表达水平及产量。此外甲醇酵母的表达载体都为E.coli／Pichia

Pastoris的穿梭载体，其中含有E.coli复制起点和筛选标志，可在获得克隆后采用E.coli细胞大量扩增.目前，将质粒载体转入酵母菌的方法主要有原生质体转化法、电击法及氯化锂法等。七、蛋白的诱导表达

七、蛋白的诱导表达

甲醇酵母一般先在含甘油的培养基中生长。培养至高浓度。再以甲醇为碳源诱导表达外源蛋白。这样可以大大提高表达产。利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达克级。与酿酒酵母相比其翻译后的加工更接近哺乳动物细胞，不会发生超糖基化。七、蛋白的诱导表达

利用PAXOI表达外源蛋白时,一般需很长时间才能达到峰值水平，而甲醇是高毒性、高危险性化工产品。使得实验操作过程中存在不小的危害性。且不宜于食品等蛋白生产。因此那些不需要甲醇诱导的启动子受到青睐包括GAP、FLD1、PEX8、YPTI等多种。利用三磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)启动子代替PAXOI，不需要甲醇诱导。培养过程中无需更换碳源，操作更为简便，可缩短外源蛋白到达峰值水平的时间。七、蛋白的诱导表达

酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统，由于兼具原核以及真核表达系统的优点，正在基因工程领域中得到日益广泛的应用。七、蛋白的诱导表达

2、昆虫细胞表达系统杆状病毒表达系统是目前应用最广的昆虫细胞表达系统，该系统通常采用目宿银纹夜蛾杆状病毒(AcNPV)作为表达载体。在AcNPV感染昆虫细胞的后期，核多角体基因可编码产生多角体蛋白，该蛋白包裹病毒颗粒可形成包涵体。核多角体基因启动子具有极强的启动蛋白表达能力，故常被用来构建杆状病毒传递质粒。七、蛋白的诱导表达克隆入外源基因的传递质粒与野生型AcNPV共转染昆虫细胞后可发生同源重组，重组后多角体基因被破坏，因而在感染细胞中不能形成包涵体，利用这一特点可挑选出含重组杆状病毒的昆虫细胞但效率比较低，且载体构建时间长，一般需要4~6周。此外，昆虫细胞不能表达带有完整N-联聚糖的真核糖蛋白。七、蛋白的诱导表达

在病毒感染晚期，由于大量外源蛋白的表达引起昆虫细胞的裂解，胞质内的物质释放出来，与

目的蛋白混在一起，从而使蛋白的纯化工作变得很困难，另外水解酶的释放会降解重组蛋白。为了克服以上这些困难，科学工作者先后尝试用丝蛾肌动蛋白基因启动子或杆状病毒ie-1基因启动子表达外源蛋白，但效果都不明显。Farrel等介绍了一种新型的鳞翅目昆虫细胞表达系统，该系统主要包括3个调节外源蛋白表达序列

七、蛋白的诱导表达（1）Bombyx

mori的肌动蛋白基因启动子；（2）Bombyx

mori的核型多角体病毒(BmNPV)的立早基因ie-1(编码俄IE-1蛋白，该蛋白是种转录激活因子，可在体外激活肌动蛋白基因启动子)（3）BmNPV的同源重复序列3(HR3)可作为肌动蛋白基因启动子的增强子。

三者协同作用，可使转录活性提高

1000倍以上，从而大大地提高外源蛋白的表达水平。另外目前还有一种新型的宿主范围广的杂合核多角体病毒(HyNPV)被应用于昆虫细胞表达系统的构建，该病毒由AcNPV及Bni'qP发展而来。

七、蛋白的诱导表达

昆虫细胞表达系统一般情况下杆状病毒表达系统所能表达的外源蛋白只有少部分是分泌性的，大部分为非分泌性。为了解决这个问题将Hsp70(热休克蛋白70)与外源蛋白共表达可明显提高重组蛋白的分泌水平，这是因为分泌性多肽被翻译后必须到达内质网进行加工才能被分泌至胞外。如果到达内质网前，前体多肽就伸展开来，暴露出疏水残基，残基间的相互作用可引起多肽的凝聚，这对最终的表达水平有很大影响。而Hsp70是一种分子伴侣，能够与新翻译的多肽结合，抑制前体肽的凝聚使前体肽顺利到达内质网进行加工，从而提高蛋白的分泌水平。

七、蛋白的诱导表达

最近，人们又构建了杆状病毒-S2表达系统，该系统能将重组杆状病毒转染果蝇S2细胞，以前人们认为杆状病毒仅能在鳞翅目昆虫细胞(如

sf9、sf21)中复制，不能在其他昆虫细胞(如果蝇细胞)中复制，然而目前研究表明在一定条件下，杆状病毒也能感染果蝇细胞。在果蝇细胞中，杆状病毒的多角体基因启动子几乎不发生作用。杆状病毒-S2表达系统的表达载体利用的是果蝇启动子如Hsp70启动子、肌动蛋白5C启动子、金属硫蛋白基因启动子等，其中，Hsp70的作用最强。七、蛋白的诱导表达重组杆状病毒感染S2细胞后不会引起宿主细胞的裂解，且蛋白表达水平与鳞翅目细胞相似，因此，杆状病毒-S2系统是一个很有应用前景的昆虫细胞表达系统。昆虫细胞表达系统，特别是杆状病毒表达系统由于其操作安全，表达量高，目前与酵母表达系统一样被广泛应用于基因工程的各个领域中。七、蛋白的诱导表达哺乳动物细胞表达系统由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质。哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。

将外源基因导入哺乳动物细胞主要通过2类方法

七、蛋白的诱导表达

一、感染性病毒颗粒感染宿主细胞，二是通过脂质体法、显微注射法

、磷酸钙共沉淀法及DEAE一葡聚糖法等非病毒载体的方式将基因导入到细胞中。外源基因的体外表达一般采用质粒表达载体，如将重组质粒导入CHO细胞可建立高效稳定的表达系统，而利用COS细胞可建立瞬时表达系统。目前，病毒载体已成为动物体内表达外源基因的有力工具，在临床基因治疗的探索中也发挥了重要作用。七、蛋白的诱导表达

利用它作为载体可同时插入几种外源基因，从

而构

建多价疫苗。另外，逆转录病毒感染效率高，某些难转染的细胞系也可通过其导入外源基因，但要注意的是逆转录病毒可整合入宿主细胞染色体，具有潜在的危险性。

七、蛋白的诱导表达

由于腺病毒易于培养、纯化，宿主范围广,故采用该类病毒构建的载体被广泛应用腺病毒载体的构建依赖于腺病毒穿梭质粒和包装载体之间的同源重组。但是哺乳动物细胞内的这种同源重组效率很低，利用细菌内同源重组法构建重组体效率会大大提高，即将外源基因插入到腺病毒穿梭质粒中，形成转移质粒，将其线性化后与腺病毒包装质粒共转化大肠埃希菌。另一种方法是通过CrelaxP系统构建重组腺病毒载体，在转移质粒和包装质粒中都插入laxP位点，然后将两个质粒共转染表达Cre重组酶的哺乳动物细胞，通过Cre介导两个laxP位点之间的DNA发生重组，可获得重组腺病毒，这种重组效率比一般的细胞内同源效率高30倍。七、蛋白的诱导表达

最近，人们在杆状病毒中插入巨细胞病毒的启动子建立了高效的基因转移载体。由于杆状病毒是昆虫病毒，在哺乳动物细胞中不会引起病毒基因的表达，而且载体的构建容易，因而利用杆状病毒进行基因转移为我们提供了很好的途径。利用哺乳动物细胞表达外源基因时，大多数情况下不需要诱导，但当表达产物对细胞有毒性时应采取诱导，这样可避免表达产物产生早期就对细胞产生影响。七、蛋白的诱导表达

哺乳动物细胞中用到的诱导型载体主要与启动子有关如热休克蛋白启动子可在高温下被诱导，还有重金属、糖皮质激素诱导的启动子。但这些系统存在一些共同的缺陷，如诱导表达特异性差；当系统处于关闭状态时表达有泄漏诱导剂本身有毒性，常对细胞造成损伤等。七、蛋白的诱导表达

四环素诱导的基因表达系统是目前应用最广泛的哺乳动物细胞诱导表达系统，该系统具有严密、高效可控制性强的优点。

外源蛋白的表达会对哺乳动物细胞产生不利影响，因此利用哺乳动物细胞表达外源基因时，一个主要问题便是外源基因不能持久稳定地表达。七、蛋白的诱导表达

Mielke等构建了一种能够在哺乳动物中稳定表达异二聚体蛋白的载体系统，在这个系统中，编码抗体重链和轻链的cDNA及嘌呤霉素抗性基因被转录成三顺反mRNA。内部的顺反子通过内核糖体进入位点(IREs)介导进行翻译，通过持续选择压力，无需繁琐的筛选过程，便可获得持久、稳定表达抗体分子的重组体。

七、蛋白的诱导表达

哺乳动物细胞表达系统常用的宿主细胞有CHO、COS、BHK、SP2／0、NIH3T3等，不同的宿主细胞对蛋白表达水平和蛋白质的糖基化有不同的影响，因此在选择宿主细胞时应根据具体情况而定。

七、蛋白的诱导表达

利用基因工程技术表达外源蛋白。其产量还不高，难以满足大规模的实际应用。通过转基因动物或转基因植物技术可从动物的乳汁或植物的叶组织中很方便地获得大量较纯的生物活性物质，但目前这项技术还不很成熟，有待进一步研究。

七、蛋白的诱导表达

目前已经建立了多种诱导表达系统，但它们都有其优点和不足，这就需要我们根据自己的要求选用适当的表达系统。一般来说，一个理想的可诱导表达系统需要符合下述几个方面的要求。

①特异性：该系统不受其他内源因素的影响，仅能被外源的非毒性药物所活化。

②非干扰性：该系统成分不能对细胞通路有干扰。

③可诱导性：该系统在非活化状态下本底活性最低，而在活化状态下能快速产生高水平的基因表达。④诱导剂的生物利用率：调节分子能快速渗透人各组织，能通过胎盘屏障及血脑屏障。⑤可逆性：诱导剂能快速被各组织清除使该系统很快恢复非活化状态。⑥剂量依赖性：该系统的反应与诱导剂的浓度成正比，以便进行定性定量分析。总之，各种表达系统各有其优缺点，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低八、实例Tet-Off蛋白诱导表达

EstablishmentofdoublestableN-JNKcelllinesandfragmentexpressionTheHA-N-JNKcDNAinsertedpUHD-10-3plasmidwastransfectedintothecellswithhighexpressionandlowbasallevelandtetwasaddedimmediatelytoafinalconcentrationof1μg/ml.Resistantcloneswereselectedbyusing600μg/mlgeneticin(G418)and100μg/mlhygromycin.

JBC,275(22),16590–16596,2000八、实例Tet-Off蛋白诱导表达

ThereisanexogenousHAtagattheN-terminusofN-JNKforavoidingtheendogenousJNK,sowhentet(1μg/ml)waspresent,N-JNKfragmentexpressionwassuppressed.

JBC,275(22),16590–16596,2000八、实例Tet-Off蛋白诱导表达Ontheotherhand,iftetwaswithdrawnbythreetimeswashingwithPBSandaddingnormalmedium,theexpressionofN-JNKincreasedwithtime,asdetectedbyWesternblot.

JBC,275(22),16590–16596,2000八、实例Tet-Off蛋白诱导表达八、实例Tet-Off蛋白诱导表达九、通过转染质粒在真核细胞

表达蛋白注意事项

在真核细胞如NIH3T3细胞中用PCDNA3质粒表达蛋白时可能会遇到表达不了或表达太少的情况，除了可以通过加大转染的质粒量外，特别要注意在基因前面加入Kosak序列ACCACCATG，这样对基因的表达会有很好的促进作用

另外可以筛选Stable-expressioncellularline来进行蛋白的稳定表达

九、通过转染质粒在真核细胞

表达蛋白注意事项

表达过程中蛋白标签序列的作用蛋白标签（proteintag）是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。九、通过转染质粒在真核细胞

表达蛋白注意事项氨基酸标签（含小肽标签）

组氨酸标签（His

tag）一般为6个组氨酸，用Ni2+

（Cu2+）亲和层析纯化FLAG

tag

：N-DYKDDDDK-C

recovered

with

specific

antibody

HA

tagan

epitope

derived

from

the

Influenza

protein

haemagglutinin

(HA，禽流感病毒血凝素)，e.g.

N-YPYDVP-Crecovery

with

an

HA

antibody

九、通过转染质粒在真核细胞

表达蛋白注意事项MYC

tag：an

epitope

derived

from

the

human

proto-oncoprotein

MYC，e.g.

N-ILKKATAYIL-C,

N-EQKLISEEDL-C

recovery

with

an

MYC

antibody

SBP

tag：Streptavidin

Binding

Peptide，链霉亲合素结合肽，38

amino

acid

tag

(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP)，九、通过转染质粒在真核细胞

表达蛋白注意事项

更多参考在Sigma

CBP

tag：钙调蛋白结合肽（CBP;

26aa）钙调蛋白结合肽与钙调素结合是Ca2+依赖的，这种结合不受标签所处的位置影响（N端和C端均可），在中性pH条件下使用2mM

EGTA可以很方便的将目标蛋白洗脱下来。这一系统有如下优点：1

特异性很高，因为大肠杆菌没有可以和钙调素结合的蛋白；2

与His标签相比可以在强还原性条件下纯化。

纤维素结合肽（CBD）：能与纤维素介质特异性的结合，可以在温和的条件下洗脱（乙二醇或低盐条件），pET

CBD

载体含有纤维素结合肽（CBD）的序列，可方便构建。

九、通过转染质粒在真核细胞

表达蛋白注意事项二、蛋白质标签

GST

tag：

the

small

glutathione-S-transferase

(GST;

26

kDa)

recovery

by

affinity

to

substrate

glutathione

bound

to

a

column,

e.g.

glutathione

sepharose

MBP

tag：麦芽糖结合蛋白（MBP;

40kDa）载体：pMAL

IMPACT：Intein-Mediated

Purification

with

an

affinity

Chitin-binding

Tag（几丁质结合肽）

九、通过转染质粒在真核细胞

表达蛋白注意事项硫氧还蛋白：Thioredoxins

are

proteins

that

act

as

antioxidants

by

facilitating

the

reduction

of

other

proteins

by

cysteine

thiol-disulfide

exchange.

Protein

A：

a

40-60

kDa

MSCRAMM

surface

protein

originally

found

in

the

cell

wall

of

the

bacteria

Staphylococcus

aureus.

It

has

found

use

in

biochemical

research

because

of

its

ability

to

bind

immunoglobulins.

It

binds

proteins

from

many

of

二、蛋白质标签mammalian

species,

most

notably

IgG’s.

It

binds

with

the

Fc

region

of

immunoglobulins