基因组与蛋白质组

基因组与蛋白质组第一页，共五十五页，编辑于2023年，星期日问题细胞周期的不同时期个体发育不同阶段不同的器官和组织不同的外界环境下各种基因的表达与否、量的差异、表达部位如何第二页，共五十五页，编辑于2023年，星期日5.转录物组5.1Northern杂交杂交主要步骤：

提取总RNA（不同组织、不同器官）

↓变性电泳↓制备目的基因探针转移尼龙膜（放射性或化学标记法）

杂交

↓扫描或放射自显影

↓依据杂交信号的强弱、有无判断基因的表达部位、表达量、表达时期等

第三页，共五十五页，编辑于2023年，星期日5.2SAGESAGE（serialsanalysisofgeneexpression）基因表达系列分析

1995Velculescu及其同事年创立第四页，共五十五页，编辑于2023年，星期日SAGE特点：进行转录物组研究，也就是转录水平的研究；通过快速和详细分析成千上万个EST来寻找出表达丰度不同的SAGE标签序列，从而接近完整地获得基因组的表达信息；

SAGE区别于差异显示、消减杂交等其它技术的主要特点是可用于寻找那些较低丰度的转录物，最大限度地收集基因组的基因表达信息，这使之成为从总体上全面研究基因表达、构建基因表达图谱的首选策略；SAGE可用于在不同环境、不同生理状态及不同生长阶段的细胞和组织表达图谱构建，对不同状态下基因表达水平的定量或定性比较，特别是对疾病组织与正常组织的比较发展迅速；

第五页，共五十五页，编辑于2023年，星期日SAGE技术的主要理论依据：来自转录物内特定位置的一小段寡核苷酸序列（9~11bp）含有鉴定一个转录物特异性的足够信息，可作为区别转录物的标签（tag）；通过简单的方法将这些标签串联在一起，形成大量多联体（concatemer），对每个克隆到载体的多联体进行测序，并应用SAGE软件分析，可确定表达的基因种类，并可根据标签出现的频率确定基因的表达风度（abundance）。第六页，共五十五页，编辑于2023年，星期日1.将5μg含有oligodT（引物）的磁珠与RNA混合。2.合成双链cDNA。

3.用NlaⅢ酶消化形成一条链末端有标签的产物。

4.将样品分成两份，连接成含有识别序列的产物，以备用BsmF1消化。5.用MmeI切割每一个样品形成约60bp的标签。SAGE步骤第七页，共五十五页，编辑于2023年，星期日6.延伸5秒，连接成约130bp的双链标签。

7.PCR扩增。8.用NlaⅢ酶切130bp产物释放34bp双链标签。9.连接片断形成串联体。

10.克隆到pZErO-1+里，并测序。

第八页，共五十五页，编辑于2023年，星期日SAGE实例第九页，共五十五页，编辑于2023年，星期日5.3基因芯片何为生物芯片?

生物芯片主要指通过平面微细加工技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。它是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。第十页，共五十五页，编辑于2023年，星期日生物芯片分类第十一页，共五十五页，编辑于2023年，星期日

基因芯片技术是指通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。基因芯片第十二页，共五十五页，编辑于2023年，星期日基因芯片发展历史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray第十三页，共五十五页，编辑于2023年，星期日基因芯片的主要应用基因表达检测拟南芥、酵母基因表达研究等突变检测BRCAⅠ基因外显子、CFTR基因、β-地中海贫血、酵母突变菌株、HIV-1逆转录酶及蛋白酶基因等的突变检测等基因组多态性分析人类基因组单核苷酸多态性的鉴定及分系析，人线粒体16.6kb基因组多态性的研究等基因文库作图通过确定重叠克隆的次序从而对酵母基因组进行作图第十四页，共五十五页，编辑于2023年，星期日TypesofDNAChips第十五页，共五十五页，编辑于2023年，星期日基因芯片研制的总体蓝图

研制方向的确定基因组序列分析与待检基因探针序列的确定检测样品的制备探针阵列的准备检测设备的研制杂交检测与数据分析第十六页，共五十五页，编辑于2023年，星期日表达芯片的制备检测流程第十七页，共五十五页，编辑于2023年，星期日表达芯片实例PCR法从外周血淋巴细胞cDNA文库扩增产物扩增产物点样于包被的玻片上DNA芯片热击T细胞cDNA未处理的细胞cDNA

杂交杂交激光共聚焦扫描发现17个差异表达基因,11个被热诱导,6个被热抑制,发现其中3个为未发现的新基因第十八页，共五十五页，编辑于2023年，星期日6.蛋白质组

DNAmRNAPROTEIN(活性)转录水平调控(transcriptionalcontrol)翻译水平调控(Translationalcontrol)翻译后水平调控(Post-translationalcontrol)第十九页，共五十五页，编辑于2023年，星期日6.1蛋白质组(Proteome)

Proteome来源于Proteins和genome

两个词的组合,意思是Proteinsexpressedbyagenome,即基因组表达的蛋白质.第二十页，共五十五页，编辑于2023年，星期日蛋白质组定义广义上是指某种细胞或组织中基因组表达的所有蛋白质;

狭义上,可以指不同时期细胞内蛋白质的变化.蛋白质组学定义研究蛋白质组结构和功能的领域称为蛋白质组学.蛋白质组学的研究内容:

分析全部蛋白质组所有成分以及它们的数量;

确定各种组分所在的空间位置、修饰方法、互作机制、生物活性和特定功能等

第二十一页，共五十五页，编辑于2023年，星期日6.2蛋白质组分析复杂性蛋白质有许多加工方式,如磷酸化、糖基化、乙酰化、泛素化等；mRNA的可变剪接、程序性移码和可控突变，1个基因可编码许多不同的蛋白质，常常表现为组织特异性；蛋白质之间存在大量的相互作用，如形成同源或异源二聚体、三聚体或多聚体，不同的结合状态有不同的活性；1种蛋白质可参与多种反应，或多种蛋白质参与1种反应。第二十二页，共五十五页，编辑于2023年，星期日6.3蛋白质组研究技术

蛋白质组主要研究技术：双向电泳生物质谱技术蛋白质芯片酵母双杂交第二十三页，共五十五页，编辑于2023年，星期日6.3.1双向凝胶电泳

样品制备（包括蛋白质的溶解、变性及还原，从而去除非蛋白质杂质等）→第一向等电聚焦（根据蛋白质电荷差异进行分离）→第二向SDS（以蛋白质分子量差异为基础）→蛋白质的检测（用考马斯亮蓝、银染、铜染等方法）→图谱数字化分析（图象扫描、确定每个蛋白质点的等电点和分子量，寻找差异蛋白）第二十四页，共五十五页，编辑于2023年，星期日6.3.2蛋白质组分析技术主要蛋白质组分析技术：质谱方法蛋白质序列分析氨基酸组成分析第二十五页，共五十五页，编辑于2023年，星期日质谱技术的基本原理：样品分子离子化后，根据不同离子间质核比（m/z）的差异来分离并确定分子量。质谱仪组成：进样装置、离子化源、质量分析器、离子检测器和数据分析系统组成。第二十六页，共五十五页，编辑于2023年，星期日质谱技术在蛋白组研究中的应用：A肽质谱和肽序列分析蛋白质经双向电泳后，分离到的蛋白质被切割下来，进行胶内酶解，或转移到PVDF膜上，进行膜上膜解，然后上样进行测序。但目前质谱法还不能够取代Edman降解法测序，可是其测定速度较快。第二十七页，共五十五页，编辑于2023年，星期日B鉴定翻译后修饰的蛋白质质谱可通过特征离子监测的方法很快确定磷酸化肽，通过串联质谱确定磷酸化位点；质谱可与蛋白酶解和糖苷酶酶解结合，寻找糖肽，鉴定糖基化位点；质谱还参与糖链组成、结构甚至分支情况等的分析。

第二十八页，共五十五页，编辑于2023年，星期日C质谱技术的其他作用质谱可对蛋白质二硫键进行定量和定位，分析蛋白质与蛋白质的相互作用，蛋白质与其他分子的相互作用，以及蛋白质的二级结构等。第二十九页，共五十五页，编辑于2023年，星期日6.4蛋白质组数据库的建立和生物信息学数据库的建立是蛋白质组研究的最重要的一个方面。

蛋白质的数据库包括：蛋白质序列数据库质谱数据库双向电泳图谱数据库有关蛋白质结构的数据库

第三十页，共五十五页，编辑于2023年，星期日6.5与疾病相关蛋白质研究的基本策略第三十一页，共五十五页，编辑于2023年，星期日6.6蛋白质组研究的目的建立蛋白质互作网络为人们了解生物体的各个生长、发育期的各个蛋白质有机组成、协作，更完整的解释各种生命现象奠定基础促进人类疾病的治疗第三十二页，共五十五页，编辑于2023年，星期日第三十三页，共五十五页，编辑于2023年，星期日本章要点已知一个DNA片段，如何预测其开放读码框?RACE技术的基本原理是什么?动物园杂交的原理基因剔除法RNAi的作用原理及应用酵母双列杂交的原理SAGE的基本原理及技术路线什么是蛋白质组、蛋白质组学，以及蛋白质组的研究目的和意义？第三十四页，共五十五页，编辑于2023年，星期日第三章物理作图(physicalmapping)物理作图:

应用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组的实际位置物理图的距离:

依作图方法而异,辐射杂种作图的计算单位为厘镭(cR);限制性片段作图与克隆作图的图距单位为碱基对(bp)第三十五页，共五十五页，编辑于2023年，星期日物理作图的方法

限制酶作图(RestrictionMapping)

依靠克隆的基因组作图(clone-basedmapping)

荧光原位杂交(Fish,Fluorescentinsituhybridization)

序标位作图(STS，Sequencetagedsite)第三十六页，共五十五页，编辑于2023年，星期日1.限制性作图

它是将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置.

其只能应用于较小的DNA分子,其上限取决于作图分子中限制酶位点的频率.

通常采用的6碱基对识别顺序的限制酶仅适合50Kb以下DNA分子的精确作图.第三十七页，共五十五页，编辑于2023年，星期日1.1限制酶作图(RestrictionMapping)基本原理1KbEcoRI待检的DNABamHI15Kb6Kb5Kb10Kb9KbEBBHHEHHHHE+BEB6KbEH4KbEB5KbBH第三十八页，共五十五页，编辑于2023年，星期日跨叠克隆群(Contig)酶切位点第三十九页，共五十五页，编辑于2023年，星期日1.2限制酶作图的改进脉冲凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis)稀有切点限制图绘制第四十页，共五十五页，编辑于2023年，星期日稀有切点限制图绘制注意事项:

识别顺序越长产生的片段越大;

识别位点碱基的组成影响限制性片段的大小;

如人类基因组A/T比例接近60/%,选用高比例A/T位点限制酶,产生的片段多于高比例G/C识别位点酶有些限制酶识别位点较长如酵母的Ⅰ-Sce识别顺序为18bp,

如果高等真核生物基因组中无此序列,可通过转座子转座和噬菌体转导的方法将其引入代测基因组中.

基因组DNA的甲基化状态如人类活细胞基因组中大量5’-CG-3’顺序的胞嘧啶被甲基化,使许多含有5’-CG-3’顺序的内切酶很少找到可切位点.第四十一页，共五十五页，编辑于2023年，星期日2.1大片段DNA的克隆载体

YAC:酵母人工染色体230-1700KbBAC:细菌人工染色体300KbPAC:P1人工染色体300KbFosmids:30Kb2.基于克隆的基因组作图第四十二页，共五十五页，编辑于2023年，星期日2.2重叠群组建重叠群:相互重叠的DNA片段组成的物理图.重叠群的组建方法染色体步移法第四十三页，共五十五页，编辑于2023年，星期日

指纹作图法

指纹:系指确定DNA样品所具有的DNA片段;

一个克隆的指纹表示了该克隆所具有的限定的顺序特征.

常用的指纹分析方法:A限制性带型(restrictionpatterns)指纹

B重复顺序DNA指纹(repetitiveDNAfingerprints)CSTS目录作图(STScontentmapping)D重复DNAPCR(repetitiveDNAPCR)或分散重复顺序PCR(interspersedrepeatelementPCR,IRE-PCR)指纹第四十四页，共五十五页，编辑于2023年，星期日第四十五页，共五十五页，编辑于2023年，星期日3.荧光原位杂交(Fish,Fluorescentinsituhybridization)将探针用荧光标记，与细胞分裂中期的染色体杂交，用荧光显微镜观察信号所处的位置，将探针标定在连锁图上。第四十六页，共五十五页，编辑于2023年，星期日用DNA纤维分析水稻第4号染色体第四十七页，共五十五页，编辑于2023年，星期日4.序标位作图

(STS,SequenceTagedSite)长度:100-500bp序列已知,可以设计PCR反应单拷贝,在染色体上的位置是唯一的EST(Expressedsequencetag)大部分可以作STS第四十八页，共五十五页，编辑于2023年，星期日4.1STS作图原理第四十九页，共五十五页，编辑于2023年，星期日4.2寻找STS的方法:表达顺序标签(expressedsequencetag，EST)

从cDNA中找到的小段顺序,但基因家族成员间共有的序列不能用于STS。SSLP（simplesequencelengthpolymorphisrns，SSLPs）随机基因组顺序第五十页，共五十五页，编辑于2023年，星期日EST1990