可见紫外分光光度法

可见紫外分光光度法第一页，共三十二页，编辑于2023年，星期日主要内容第一节物质的吸收光谱第二节分光光度法基本原理第三节可见分光光度法

第四节提高测量灵敏度和准确度的方法第五节紫外分光光度法简介第二页，共三十二页，编辑于2023年，星期日目的要求掌握分光光度法的基本原理——Lambert-Beer定律；吸光度及透光率、吸光系数、摩尔吸光系等概念、相互关系及计算。熟悉标准曲线法及标准对照法。了解吸收光谱的意义及绘制方法。了解分光光度计的基本构造,提高测量灵敏度和准确度的方法。了解可见分光光度法和紫外分光光度法的异同点。

第三页，共三十二页，编辑于2023年，星期日分光光度法

根据物质的吸收光谱及光的吸收定律，对物质进行定性、λυ定量分析的一种方法。第四页，共三十二页，编辑于2023年，星期日预习问题与提纲1．在吸收光谱中，定性分析和定量分析的依据是什么？2．

Lambert–Beer定律的公式及应用？3．可见分光光度法有哪两种？

4．分光光度法的误差有哪些？5．如何提高分析的准确度？

第五页，共三十二页，编辑于2023年，星期日主要内容第一节物质的吸收光谱*第二节分光光度法基本原理*第三节可见分光光度法*

第四节提高测量灵敏度和准确度的方法*第五节紫外分光光度法简介*本章小结*参考文献*第六页，共三十二页，编辑于2023年，星期日第一节物质的吸收光谱

一、物质对光的选择性吸收物质对光的吸收具有选择性，若溶液选择性地吸收了某种颜色的光，则溶液呈吸收光的互补光。第七页，共三十二页，编辑于2023年，星期日第一节物质的吸收光谱二．物质的吸收光谱（A-λ图）以波长为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，可得一曲线，即为吸收光谱(absorptionspectrum)或称吸收曲线(absorptioncurve),右图为不同浓度时三(邻二氮菲)合铁(II)配离子的吸收光谱。第八页，共三十二页，编辑于2023年，星期日第一节物质的吸收光谱特点:①具有最大吸收波长。②不同物质,λmax不同，λmax

是定性分析的依据。③λmax几乎不随物质的浓度而变。第九页，共三十二页，编辑于2023年，星期日第一节物质的吸收光谱④λmax附近，A最大，并与浓度c

呈正比关系----定量分析依据。⑤远离λmax的光,物质几乎不吸收光（A→0）,这些光的A与物质的c无直接关系----不作定量分析依据。注意：物质对光的吸收越多，呈颜色越深，溶液浓度越浓。第十页，共三十二页，编辑于2023年，星期日第二节

分光光度法

基本原理

一、透光率和吸光度入射光I0

吸收Ia

透射It

I0=Ia+It透光率T=It/I0第十一页，共三十二页，编辑于2023年，星期日第二节

分光光度法

基本原理I0溶剂

I0,

I0溶液

It∴T=It/I0

透光率的负对数称为吸光度，用符号A表示。

A愈大，溶液对光的吸收愈多。吸光度A=-lgT=lgI0/It第十二页，共三十二页，编辑于2023年，星期日第二节

分光光度法

基本原理二

Lambert―Beer定律当I0一定时，A只与液层厚度（b）和溶液浓度C有关：①Io，c一定，A∝b

②Io，b一定,A∝c∴A=abc注意：Beer定律仅适用于单色光。第十三页，共三十二页，编辑于2023年，星期日第一节

物质的吸收光谱

单位：

b----cm。

a为吸光系数：Lg-1cm-1,c单位:g/L。

ε为摩尔吸光系数：L·mol-1·cm-1，c单位：mol/L，

a与ε的关系:ε=aM

M表示被测物质的摩尔质量。第十四页，共三十二页，编辑于2023年，星期日第二节

分光光度法

基本原理由Lambert―beer定律

可知吸光度与溶液浓度之间为正比关系，而透光率与溶液浓度之间为指数函数关系：-lgT=

bc

T=10-bc第十五页，共三十二页，编辑于2023年，星期日第二节

分光光度法基本原理例：已知某化合物的相对分子质量为251，将此化合物用乙醇配成浓度为0.150mmolL-1的溶液，在480nm波长处用2.00cm吸收池测得透光率为39.8%，求该化合物在上述条件下的摩尔吸光系数及质量吸光系数a。解：第十六页，共三十二页，编辑于2023年，星期日第二节

分光光度法基本原理例：测试酶与腺苷酸(AMP)体系的吸光度如下A(280nm)=0.46，A(260nm)=0.58，试计算每一组分的浓度。已知：酶的(280nm)=2.96104Lmol-1cm-1(260nm)=1.52104Lmol-1cm-1

AMP的(280nm)=2.4103Lmol-1cm-1(260nm)=1.5104Lmol-1cm-1吸收池厚度为1.00cm。第十七页，共三十二页，编辑于2023年，星期日第三节可见分光光度法

一分光光度计分光光度计仪器型号很多，但其基本原理相似，其主要部件用方框图示意如下光源→单色光器→吸收池→检测器→讯号处理及显示器第十八页，共三十二页，编辑于2023年，星期日第三节可见分光光度法二、测定方法

可见分光光度法常用于定量测定，根据Lambert-Beer定律，在一定波长条件下，吸光度与浓度成正比，因此在分光光度计上测出吸光度，通过下列方法即可求出被测物质含量:第十九页，共三十二页，编辑于2023年，星期日第三节可见分光光度法1.标准曲线法在测定溶液吸光度时，为了消除溶剂或其它物质对入射光的吸收，以及光在溶液中的散射和吸收池界面对光的反射等与被测物吸收无关的因素的影响，必须采用空白溶液(又称参比溶液)作对照。常用的空白溶液有下列三种。①溶剂空白②试剂空白③试样空白第二十页，共三十二页，编辑于2023年，星期日第三节可见分光光度法2.标准对照法先配制一个与被测溶液浓度相近的标准溶液(其浓度用cs表示)，在max处测出吸光度As，在相同条件下测出试样溶液的吸光度Ax，则试样溶液浓度cs可按下式求得：cx=csAx/As第二十一页，共三十二页，编辑于2023年，星期日第四节

提高测量灵敏度和准确度的方法一、分光光度法的误差分光光度法的误差主要来自以下几方面：1.溶液偏离Beer定律引起的误差测定条件：均匀稳定的稀溶液，单色光。2.仪器误差，A为0.2～0.7,误差较小。3.主观误差。第二十二页，共三十二页，编辑于2023年，星期日

第四节

提高测量灵敏度和准确度的方法二选择合适的显色剂条件：

1.灵敏度

2.选择性高

3.生成的有色物质有确定的组成

4.生成的有色物质要稳定

5.显色剂在测定波长处无明显吸收。第二十三页，共三十二页，编辑于2023年，星期日

第四节

提高测量灵敏度和准确度的方法三、选择合适的测定条件

1.波长的选择（入max）；

2.显色剂的用量要适量；

3.酸度（A–pH曲线）；

4.显色时间（A–t曲线）；

5.溶液浓度控制在A=0.2~0.7范围;

6.掩蔽干扰离子。第二十四页，共三十二页，编辑于2023年，星期日

第五节紫外分光光度法简介

一、751-G型分光光度计二、紫外分光光度法的应用1.定性鉴别比较max、(max)或a(max)比较吸光度(或吸光系数的比值)2.定量测定3.有机化合物的结构研究第二十五页，共三十二页，编辑于2023年，星期日第五节紫外分光光度法简介例已知维生素B12的α(361nm)=20.7Lg-1cm-1。精密称取样品30.0mg，加水溶解后稀释至1000ml，在波长361nm处用1.00cm吸收池测得样品的吸光度为0.618，计算样品溶液中维生素B12的质量分数。解

所测样品溶液中维生素B12的质量浓度：第二十六页，共三十二页，编辑于2023年，星期日本章小结分光光度法是根据物质的吸收光谱及光的吸收定律，对物质进行定性、定量分析的一种方法。以入射光的波长()为横坐标，溶液的吸光度(A)为纵坐标画出的曲线，即吸收光谱，吸收光谱中吸光度最大的波长，为最大吸收波长，用max表示。第二十七页，共三十二页，编辑于2023年，星期日本章小结分光光度法测定物质含量的依据是Lambert-Beer定律，即A=bc，此处c为物质的量浓度，称为摩尔吸光系数，若用质量浓度代替物质的量浓度c，则相应地改为a，A=ab，a为质量吸光系数，a与及物质的摩尔质量M之间的关系为：

=aM吸光度A与透光率T的关系是：A=-lgT第二十八页，共三十二页，编辑于2023年，星期日本章小结可见分光光度计是以可见光(钨灯)为光源，而紫外分光光度计是以氢灯作光源，经单色器分光后提供所需的波长进入被测溶液。定量测定时，常用的定量方法有标准曲线法、标准对照法、比吸光系数比较法以及差示分光光度法。它们各有其适用的范围。第二十九页，共三十二页，编辑于2023年，星期日本章小结为了提高测量的灵敏度和准确度，必须从以下几个方面考虑：

1.

提供测定时所需的单色光(一般为max)。

2.溶液的浓度宜小。

3.在A=0.2~0.7的范围内测量。

4.选择合适的显色剂。

5.选择合适的显色条件。第三十页，共三十二页，编辑于2023年，星期日本章小结由于许多物质在可见光区无特征吸收，而在近紫外(200nm~400nm)却有特征吸收，故需用紫外光为光源进行测定。紫外分光光度法除了定