基因操作技术详解演示文稿

基因操作技术详解演示文稿当前第1页\共有28页\编于星期四\21点优选基因操作技术当前第2页\共有28页\编于星期四\21点

第一节

DNA克隆

1DNA克隆克隆是指遗传上同一的生物体群体或由无性繁殖所产生的无性繁殖系(如株系,细胞系,菌株)DNA克隆是指含有相同DNA分子或DNA片段的的细胞群体.通过分离基因组DNA,扩增某个特定DNA片段,转化到受体细胞中增殖，可制备出一个特定DNA克隆.

DNA制备是DNA克隆及其他DNA操作的第一步骤.DNA克隆的基本程序如下:当前第3页\共有28页\编于星期四\21点DNA提取

→

分离和扩增特定DNA片段(PCR)

载体连接

↓

↓

重组体DNA

↓转化宿主细胞

↓

细胞培养(细胞克隆)

克隆筛查↓(分子杂交)

↓

靶DNA克隆

↓

表达分析与功能分析

当前第4页\共有28页\编于星期四\21点1.1DNA制备(提取)

组织细胞---→研磨破细胞---→

萃取

↓↓离心↓

分离

↓纯化↓DNA样品(

WithDNA

)当前第5页\共有28页\编于星期四\21点1.2DNA扩增(PCR)当前第6页\共有28页\编于星期四\21点1.3

转化转化是把外源DNA（重组体DNA）转移到宿主细胞中复制的过程。靶DNA

重组载体转化细胞

分子克隆载体DNA当前第7页\共有28页\编于星期四\21点2宿主细胞,载体及亚克隆宿主•宿主生物或细胞能够高速率复制外源DNA.•

多数宿主是细菌(如E.coli),培养细胞或原生质体.

•

宿主细胞通常需经感受态处理才能吸收外源DNA.

载体•载体是独立于宿主细胞的复制子.

•载体易分离,带有选择标记,并容易插入外源DNA.

•

常用的载体有:质粒,噬菌体,粘粒,细菌人工染色体和酵母人工染色体.当前第8页\共有28页\编于星期四\21点亚克隆:

亚克隆是从一个载体中将特定克隆DNA片段转移到另一载体的过程.克隆DNA分离→

限制酶切

→靶DNA片段分离收集

靶DNA片段纯化

→

载体连接

转化,筛选,克隆分析

亚克隆当前第9页\共有28页\编于星期四\21点3DNA文库

DNA文库由一个基因组的全部DNA克隆所构成,每个DNA克隆含有基因组DNA(基因组文库)或总cDNA(cDNA文库)的一个随机片段.

•基因组文库:

基因组DNA→随机片段→重组体DNA→转化↓

基因组DNA克隆

•cDNA文库:

提取总mRNA→反转录为cDNA→重组体DNA

↓

转化

↓

cDNA克隆

vectors当前第10页\共有28页\编于星期四\21点基因文库筛选是用分子探针或特殊蛋白质从基因文库中寻找特定DNA克隆的过程.DNA探针

每一克隆DNA

分子杂交(SouthernorWesternblot)

检测与定性

克隆分析:结构(序列)分析,功能分析(编码蛋白质)

比对分析(同源基因).当前第11页\共有28页\编于星期四\21点第二节质粒载体制备DNA载体是能独立复制并能插入外源DNA的小分子DNA理想载体的要求:

•高复制率;

•多个限制性内切酶识别位点(每种酶一个识别位点);

•带有选择性标记(克隆筛选标记和重组体筛选标记);

•能容纳较大的DNA片段插入.质粒是存在于细菌染色体外的小DNA分子,是最早用于基因操作的载体分子,主要用于携带外源基因进入细菌细胞中复制和表达.通常将携带外源基因的载体称为重组载体

(重组DNA)当前第12页\共有28页\编于星期四\21点1质粒•质粒是染色体外的环状DNA分子.

绝大多数质粒发现于细菌细胞中,但对细菌的代谢和生命周期是非必需的.

•质粒的存在可能赋予宿主细胞一些特性,如抗药性、耐逆性、接合性等.

•质粒能独立于宿主DNA复制.

•质粒赋予宿主的一些特性,可作为选择性标记.•质粒根据其复制特性可分为两类:

严谨型质粒(低复制率);

松驰型质粒(高复制率).

当前第13页\共有28页\编于星期四\21点重组体筛选

双标记,负选择当前第14页\共有28页\编于星期四\21点重组体筛选

蓝白斑当前第15页\共有28页\编于星期四\21点2质粒制备

培养含所需质粒的细菌株系;离心收集细菌沉淀物,再悬浮;碱裂解部分破壁增加细胞透性:

悬浮培养→裂解液→中和→离心→收集上清液

酚萃取除去蛋白质;乙醇沉淀,收集质粒DNA;DNA纯化:CsCl2

梯度离心(大量制备用)

缓冲液溶解,酚/仿萃取,乙醇沉淀

当前第16页\共有28页\编于星期四\21点质粒

DNA

制备工艺当前第17页\共有28页\编于星期四\21点质粒DNA琼脂糖凝胶电泳+当前第18页\共有28页\编于星期四\21点第三节限制性内切酶及酶切片段凝胶电泳1限制性DNA内切酶限制性内切酶催化从DNA分子内部水解磷酸二酯键,切断双链DNA限制性内切酶有特定的识别位点,且不同的限制性内切酶的识别位点的序列各不相同.

限制

-

修饰系统是生物体的主要防御机制:

►限制性内切酶在特定位点切割外来DNA,切割后的DNA片段再被其他的DNase完全水解;►甲基化酶给自身DNA的识别位点上的C或A碱基加上甲基,使限制性内切酶不能催化该位点DNA水解,从而保护宿主DNA免受破坏.

当前第19页\共有28页\编于星期四\21点限制性内切酶的分类:TypeI有特定识别位点但随机切割.TypeII有特定识别位点且在同一位置切割.TypeIII有特定识别位点但在之外几个碱基处切割DNA.

限制性内切酶TypeII

的作用特点：识别位点是回文序列.切割后产生粘性末端(3`-突出或5`-突出),可进行退火碱基配对并用DNA连接酶修复连接.少数限制性内切酶切割后可产生平端(钝端),须用特殊的DNA连接酶(如T4

DNA连接酶)连接.当前第20页\共有28页\编于星期四\21点

当前第21页\共有28页\编于星期四\21点2琼脂糖凝胶电泳反应体系:琼脂糖(0.5-2.0%);缓冲液(约pH8.0);DNA样品(上样缓冲液

+

DNA

+

EB

或其他染色剂);电场(

约100V

).当前第22页\共有28页\编于星期四\21点注意事项:在高pH条件下,所有DNA分子在缓冲液中均带负电荷,在电泳过程中将向正极迁移.迁移率与DNA分子的大小(长度)成正相关.相同大小的DNA在超螺旋状态下的电泳迁移快于线性DNA和环状DNA,线性DNA的电泳迁移快于环状DNA.较大的DNA分子须在较低浓度的凝胶上进行电泳,较小的DNA分子可用较高浓度的凝胶.当DNA与蛋白质结合时,其电泳迁移明显地减缓（凝胶阻滞）.当前第23页\共有28页\编于星期四\21点Electrophoretogram酶切片段的电泳分离当前第24页\共有28页\编于星期四\21点从琼脂糖凝胶中分离特定的DNA片段:

•切胶,熔解凝胶和去除EB;

•酚/仿萃取、离心收集和纯化DNA。

熔胶和去EB

Targe