TFu对肝门部胆管癌细胞系FRH

TFu对肝门部胆管癌细胞系FRH【摘要】目的：探讨N3邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶对FRH0201细胞的生物学效应及其作用机制，为胆管癌临床化疗提供参考。方法：光学显微镜、荧光显微镜观察FRH0201细胞在TFu作用后形态学变化；集落形成实验检测TFu对FRH0201细胞的增殖抑制作用；琼脂糖凝胶电泳检测DNALadder观察细胞的凋亡；流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡并与5Fu进行比较；MTT试验比较TFu与5Fu等常用化疗药物对FRH0201细胞抑制率。结果：TFu能体外抑制FRH0201细胞的增殖，其作用在~4mmol/L范围内具有浓度依赖性及时间依赖性，同浓度比较抑制率高于5Fu；流式细胞仪检测可见随作用时间延长，TFu及5Fu组G1细胞期增多，S期细胞减少，细胞增殖被阻滞在G1期；细胞凋亡检测可见，随作用时间延长，TFu及5Fu组较对照组细胞凋亡率增加，同时相TFu组凋亡率高于5Fu组；化疗敏感性比较，TFu抑制FRH0201细胞增殖作用不及阿霉素和顺铂，但明显优于5Fu及泰素，联合用药：阿霉素、顺铂和TFu联合对FRH0201细胞抑制率最高，达%，优于阿霉素、顺铂、5Fu联合。结论：TFu可明显抑制胆管癌细胞株FRH0201细胞的增殖，该抑制作用可能通过阻滞细胞周期并进一步诱导细胞凋亡机制发生，同摩尔浓度TFu较5Fu对FRH0201细胞抑制作用强，TFu可作为胆管癌联合化疗的新药。

【关键词】胆管肿瘤・N3邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶・氟脲嘧啶・细胞凋亡・细胞周期

TheeffectofTFuontheapoptosisandproliferationofFRH0201cholangiocarcinomacellline

【ABSTRACT】Objective:ToinvestigatetheeffectofTFuonFRH0201cellandtotestnewdrugsforthechemotherapyof:MorphologicalchangeswereobservedbylightmicroscopyandfluorescenceeffectofTFuonFRH0201cellwasexaminedbyclonecycleandapoptosiswereexaminedbyflowcytometricladderwasusedtodetectcomparethedrugsusceptibilityofTFuwith5FuandseveralothercommondrugsbyMTTcolorimetric:TFusignificantlyinhibitedtheproliferationandcloneformationofFRH0201celllinewithinconcentrationof~4mmol/inhibitionratiowasdependentonascendingconcentrationandtime,andthatishigherthan5FuwiththesamemorphologicalcharacterofapoptosiswascytometricanalysisindicatedthatTFuinducedaG1phasearrestandapoptosismorethan,DDPandTFuwerethesensitivedrugstoFRH0201celline,andthecombinationofthemcanreachthehighestinhibition:TheseresultssuggeststhatTFucanmoresignificantlyinhibitedtheproliferationofFRH0201celllinethanmechanismmayberelatedtothecellcyclearrestinassociationwithapoptosis,whichmayprovideanewapproachfortreatingcholangiocarcinoma.

【KEYWORDS】Biliary・TFu・Fluorouracil・Apoptosis・Cellcycle肝门部胆管癌是一种起病隐匿，根治困难，预后很差的消化系统恶性肿瘤，目前认为应采取包括手术、放疗、化疗介入等的综合治疗措施［1］，其中化疗占非常重要的地位。但胆管癌对常规化疗药物敏感性差，化疗效果不理想，而且存在明显的副作用，因此很多学者都在寻找新的化疗药来提高胆管癌疗效。N3邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶，胰蛋白酶(Amresco公司华美生物制品公司产品)，新生小牛血清(杭州四季青公司产品)。四甲基偶氮唑蓝、二甲基亚砜、吉姆萨色素购自Sigma公司。AnnexinVFITC/PI双染凋亡试剂盒。

方法

细胞培养FRH0201细胞接种于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，在5%CO2培养箱内37℃、饱合湿度下培养，细胞贴壁生长稳定，2~3d后细胞接近铺满瓶底，进行细胞传代。

形态学观察将FRH0201细胞接种于24孔板内，加入含不同浓度TFu的培养液，使其终浓度为8、6、4、2、1、、、/L，并设对照组，每种浓度3个复孔，连续观察。72h后Giemsa染色观察细胞形态。制作细胞飞片，上述浓度TFu作用72h，取出玻片，PBS洗2次，甲醇固定15min，%吖啶橙染色5min，PBS临时封片，荧光显微镜下观察。

集落形成能力测定常规收集细胞接种于24孔板中，每孔50个细胞，培养24h后细胞贴壁，弃掉培养液，加入TFu浓度为~8mmol/L的培养液，并设对照组，每种浓度设3个复孔，培养至肉眼可见细胞克隆时行Giemsa染色，镜下计数＞50个细胞的克隆数，计算克隆形成率。

DNALadder测定常规收集不同用药组与对照组细胞，PBS洗1次，离心收集细胞，加入白细胞裂解液，酚/氯仿液抽提，提取DNA，70%乙醇洗DNA，真空抽干，溶于TE缓冲液中，常规%琼脂糖凝胶电泳，电压80V，电泳40min，观察并摄片。

流式细胞仪检测细胞周期及凋亡分别收集＞1×１０６个TFu、5Fu浓度为/L作用24、48h的细胞，对照组为未加药的同期生长细胞，1000r/min离心5min，PBS洗涤1次，再次离心去上清。各取大约1×105个细胞按AnnexinVFITC/PI双染凋亡试剂盒说明分别加入AnnexinV和PI上机检测；其余细胞用70%预冷乙醇固定，4℃过夜；离心弃乙醇，3mlPBS重悬；400目筛网过滤，离心去上清；1ml碘化丙锭4℃避光染色30min；流式细胞仪检测，激发波长为488nm，发射波长为630nm。

MTT实验将FRH0201细胞接种于5块96孔板中，每孔2×103个细胞，培养24h后细胞贴壁，弃掉培养液，实验组加入含~4mmol/LTFu的培养液，对照组加入含有相同摩尔浓度5Fu的培养液，阴性对照组只加培养液，继续培养。加药后24、48、72、96、120h向每孔内加入20μlMTT，继续培养4h后吸出孔内液体，每孔加入150μlDMSO振荡10min，空白孔调零，波长540nm，在DG5031型酶联免疫检测仪上测定各孔吸光值，并计算抑制率。抑制率=×100%。以时间及浓度为横轴，抑制率为纵轴，绘制抑制率曲线。通过药物抑制浓度计算软件计算IC50。

药物化疗敏感性比较比较TFu及5Fu、阿霉素、顺铂、丝裂霉素、长春新碱、依托泊苷、泰素7种临床常用化疗药物，其实验浓度根据临床常用量采用公式计算出的血浆峰浓度［4，5］，联合用药组采用×PPC，TFu、5Fu分别与ADM及ADM、DDP联合。将FRH0201细胞以每孔5×103接种96孔板，细胞贴壁后加入不同的药物及药物联合继续培养，并设对照组，每组设5个复孔，72h后按方法检测每孔OD值并计算每组抑制率。

统计学方法流式细胞术结果采用列联表资料的χ2检验，MTT实验结果采用t检验及方差分析。

2结果

形态学变化当TFu浓度高于4mmol/L时细胞培养24h后逐渐变圆，不再贴壁，逐渐死亡，台盼兰染色无活细胞。4~/L组细胞随着药物浓度降低细胞生长密度逐渐升高，细胞逐渐伸展，死亡细胞逐渐减少。

Giemsa染色：对照组细胞贴壁伸展良好，细胞透光好，核仁清晰；药物作用组细胞皱缩，胞膜出芽形成凋亡小体，核固缩、浓染，核染色质边集，核仁不清。

吖啶橙荧光染色见药物作用后细胞变小变圆，部分细胞核染色黄绿色，核碎裂、无核仁，碎裂的核由膜包裹着突起于细胞表面呈黄绿色，并见凋亡小体。见图1。图1吖啶橙染色示TFu作用后FRH0201细胞形态学变化

上：对照组细胞伸展良好，胞浆均质，核仁清晰

下：实验组组细胞变小变圆，细胞皱缩，细胞核浓染成黄绿色，核仁不清

集落形成实验FRH0201细胞生长旺盛，培养至12d肉眼可见克隆团，对照组克隆形成率为(±)%，/L组克隆形成率为%，/L组克隆形成率为%，大于此浓度组无克隆形成。

DNALadder测定结果不同浓度TFu作用后，随浓度升高，出现的DNALadder条带越明显，各浓度组均出现典型的凋亡ladder条带。见图2。

流式细胞术结果细胞周期检测可见，随着作用时间延长，用药组相对于对照组G1期细胞增加，S期细胞减少，细胞生长被阻滞在G1期，同时相TFu组G1细胞比例高于5Fu组。细胞凋亡检测可见，随作用时间延长各组细胞早期凋亡率升高，TFu、5Fu组与对照组以及TFu组与5Fu组差异有统计学意义。各时相比较，TFu与5Fu组24h与48h凋亡率差异无统计学意义，24h与72h，48h与72h凋亡率差异有统计学意义。见表1，2。图2电泳法检测FRH0201细胞DNALadderM:Marker;C1~C5:4、1、、、/LTFu作用72h对照：未加药细胞表1各组细胞不同时相细胞周期比例分析表2各组细胞不同时相凋亡率比较

MTT实验结果在~4mmol/L范围内，各浓度组TFu及5Fu对FRH0201细胞增殖均有抑制作用，并且具有浓度、剂量依赖性，作用时间相同时，随药物浓度升高，抑制率升高，两组在72h比较差异有统计学意义，TFu组抑制率高于5Fu组；相同浓度下两者比较，随作用时间延长，TFu组与5Fu组抑制率均升高，浓度为4mmol/L时，差异无统计学意义，当浓度分别为1、、、/L时，两者抑制率比较差异有统计学意义，TFu组抑制作用高于5Fu组。TFu、5Fu的IC50值分别为、/L。见表3。

化疗敏感性比较TFu能有效抑制FRH0201细胞的增殖，抑制率为%，抑制作用优于5Fu及泰素，不及阿霉素和顺铂。见图3。联合用药：TFu与阿霉素联合后抑制率由%提高到%，接近阿霉素与顺铂联合，高于阿霉素与5Fu联合；阿霉素、顺铂与TFu联合后抑制率可由原来的%提高到%，高于和5Fu联合。见图4。表3不同时间不同浓度TFu及5Fu对FRH0201细胞抑制率图4TFu不同联合方案对FRH0201细胞抑制率比较

3讨论

TFu是在5Fu基础上研制的新型抗癌药，研究表明TFu能体外、体内抑制小鼠S180实体瘤及小鼠肝癌实体肿瘤增殖。本实验发现TFu在~4mmol/L范围内能有效抑制胆管癌细胞增殖，作用72h后细胞数明显减少并出现细胞凋亡形态学变化，细胞克隆形成明显受到抑制，其抑制作用具有时间、剂量依赖性。当作用时间一定时，随着药物浓度的增加，TFu对胆管癌细胞的生长抑制率逐渐升高，当药物浓度一定时，随作用时间延长，抑制率也明显升高，不同浓度不同作用时间TFu与5Fu组之间的抑制率差异有显着性。随着TFu浓度的提高，其对胆管癌细胞生长的抑制作用和促进凋亡作用变得更为明显，而且发生作用的时间更短。

本实验通过流式细胞术发现TFu作用24h后即出现G1期细胞比例增加，S期细胞比例减少，细胞生长被阻滞在G1期，随作用时间延长该阻滞作用变明显，且优于5Fu。细胞凋亡检测，作用24h后，TFu、5Fu组与对照组间凋亡率差异尚不明显，48h后开始变明显，至72h凋亡率明显升高。细胞凋亡迟于细胞周期阻滞出现，推测这种细胞周期的阻滞抑制了细胞生长，从而最终引起细胞凋亡。TFu促FRH0201细胞凋亡作用在一定范围内随药物浓度升高而增大，DNALadder检测可见，随TFu浓度升高Ladder条带越明显。研究发现，有一种细胞凋亡特异性的发生在细胞周期的不同时相，即细胞先被阻滞在细胞周期某一时相，然后发生细胞凋亡［6］，很多药物通过这种机制诱导细胞凋亡［7］。我们的实验结果，可以从侧面进一步验证了他们的发现，同时这一发现也说明了TFu在作用于胆管癌细胞时的可能的作用机制，其具体的作用机制尚有待于进一步的研究。

目前临床上针对胆管化疗的药物较敏感的有阿霉素、顺铂、5Fu联合应用，本实验发现阿霉素、顺铂与TFu联合后可提高的联合用药抑制率，优于与5Fu联合，这可为临床制定胆管癌化疗方案提供参考。

TFu与5Fu相比可更有效抑制FRH0201细胞的增殖并能促进细胞的凋亡，其发挥作用的机制可能是通过阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡途径发生实现的；TFu有望作为临床胆管癌联合化疗的新的参考用药。但该实验只是对胆管癌一种细胞株的体外实验研究