药剂学课件第二十二章 生物技术药物制剂

1第二十二章

生物技术药物制剂2内容提要生物技术药物如蛋白质、多肽和抗体等新药的数量不断上升，且在重磅药物（blockbusterdrugs）中占很大比重。生物技术药物特异性强，药效高，副作用小。生物技术药物分子量大、结构复杂，亲水性强和解离特性难以透过生物膜，且血浆半衰期短，多采用一日多次注射的给药方式。3内容要求掌握生物技术药物的特点；熟悉蛋白多肽类药物的结构及其不稳定性。了解蛋白多肽类药物的新型给药系统。4第一节概述生物技术（Biotechnology）是应用生物体（包括微生物、动植物细胞）或其组成部分（细胞器和酶），在最适条件下，生产有价值的产物或进行有益过程的技术。现代生物技术主要包括：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程、蛋白质工程、抗体工程等。第一节 概述5生物技术药物（Biotechdrugs）是指利用现代生物技术（如基因工程、细胞工程、抗体工程等）制备的蛋白质、多肽或核酸类药物。生物技术药物的特点：分子靶向性、药理活性强、剂量小稳定性差口服吸收差半衰期短生物技术药物生物技术药物的发展1982年,重组人胰岛素上市1998年,65个生物药物上市，2600个进入临床前，700多个进行临床评价，200多种进入III期临床分子生物学和生物技术快速发展，2000年后生物技术药物新药获批数量增加67重磅药物（blockbusterdrugs）药品名称适应症销售额（10b/2012）Adalimu

mab（阿达木单抗）类风湿关节炎9.27Inflixi

mab（英夫利昔单抗）银屑病、强直性脊柱炎、类风湿关节炎、溃疡性结肠炎8.22Etanercept（依那西普）自身免疫疾病7.96fluticasone哮喘、肺气肿7.90Rituxi

mab（利妥昔单抗）淋巴瘤、白血病、器官移植排斥6.65Insulin

glargine（甘精胰岛素）糖料病6.40Trastuzu

mab（曲妥珠单抗）乳腺癌6.25Rosuvastatin搞胆固醇血症、心血管疾病6.26Bevacizu

mab(贝伐珠单抗）各种癌症5.38生物药物制剂开发面临的挑战分子量大、亲水性，导致其膜通透性差，大部分采用注射给药，以保证生物利用度。半衰期短，频繁给药，病人顺应性差。结构复杂，药物稳定性差（聚集、构象），制备、贮藏难度大。在胃肠道中容易酶、pH影响，容易失活。非注射给药的制剂开发尚未开发成功。89生物技术药物制剂戈舍瑞林可注射埋植剂降钙素溶液注射剂胸腺肽冻干粉注射剂环孢素A自乳化软胶囊10第二节蛋白和多肽类药物制剂蛋白质结构可分为一、二、三、四级结构：

一级结构：为初级结构，指蛋白质多肽链中的氨基酸排列顺序，包括肽链数目和二硫键位置。高级结构：二、三、四级结构为高级结构或空间结构，高级结构和二硫键与蛋白质的生物活性有重要关系。一、蛋白多肽类药物的结构与理化性质11蛋白质的一级结构蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序排列，通过肽键相连而成的多肽链。蛋白质分子量很大，一般在5×103--5×106。蛋白质的肽链结构包括氨基酸组成、氨基酸排列顺序、肽链数目、末端组成和二硫键的位置等。12二级结构：指多肽链骨架的折叠方式，即肽链主链有规律的空间排布，一般有α螺旋结构与β折叠形式。三级结构：指已折叠的肽链在分子中的空间构型，系一条多肽链中所有原子的空间排部。四级结构：指具有三级结构的各亚基聚合而成的大分子蛋白质。蛋白质的高级结构13蛋白质的理化性质旋光性紫外吸收蛋白质两性本质与电学性质14（1）旋光性蛋白质分子总体旋光性由构成氨基酸各个旋光度的总和决定，通常是右旋，它由螺旋结构引起。蛋白质变性，螺旋结构松开，则其左旋性增大。（2）紫外吸收大部分蛋白质均含有带苯核的苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸，苯核在紫外280nm有最大吸收。氨基酸在紫外230nm显示强吸收。15（3）蛋白质两性本质与电学性质蛋白质除了肽链N-末端有自由的氨基和C-末端有自由的羧基外，在氨基酸的侧链上还有很多解离基团，如赖氨酸的-氨基，谷氨酸的γ羧基等。这些基团在一定pH条件下都能发生解离而带电。因此蛋白质是两性电解质，在不同pH条件下蛋白质会解离成阳离子或阴离子。16二、蛋白质和多肽类药物的稳定性（一）化学稳定性

脱酰胺化水解氧化二硫键断裂及重排其他17例如：蛋白多肽中天冬酰胺侧链酰胺攻击肽键，形成丁二酰亚胺，进一步水解，发生脱酰胺化。化学稳定性--脱酰胺化18蛋白质的水解蛋白质可被酸、碱和蛋白酶催化水解，使蛋白质分子断裂，分子量逐渐变小，成为分子量大小不等的肽段和氨基酸。蛋白质的氧化序列中有可能参与氧化的氨基酸可以在一些氧化剂的作用下氧化(如甲硫氨酸氧化成亚砜)，使一些多肽类激素和蛋白质失去活性。化学稳定性19二硫键断裂及重排二硫键对稳定蛋白质的构象起重要作用。在某些蛋白质中，二硫键一旦破坏，蛋白质的生物活性即丧失。其他：外消旋作用当蛋白质用碱水解时往往会使某些氨基酸产生消旋作用。消旋作用一般能使氨基酸成为非代谢的形式20（2）物理稳定性聚集（aggregation)，宏观沉淀，和表面吸附导致蛋白质变性，这些都是由于与空间构象有关的非共价键引起。包括非共价的静电力，氢键，疏水键的相互作用以及蛋白质的水化。温度、pH、离子强度等影响稳定性21（三）蛋白质药物稳定性的分析方法液相色谱法:评价蛋白质的纯度与稳定性;常用RP-HPLC、IEC与SEC。光谱法:通过对蛋白质吸收、辐射、散射光的定量分析可以了解蛋白质的量、构象和聚集倾向。常用紫外、可见吸收光谱、旋光色散、圆二色谱、荧光、红外和拉曼光谱。电泳:可分离混合蛋白质;常用SDS、IEF和CE生物活性测定与免疫测定22三、蛋白质类药物制剂的处方与工艺（一）蛋白质类药物的一般处方组成蛋白质类药物注射剂的分类：溶液型注射剂：使用方便，但需在低温（2-8°C）下保存。粉针：比较稳定，但工艺较为复杂。23（二）液体剂型中蛋白质类药物的稳定化在液体剂型中蛋白质药物的稳定化方法分为两类：①改造其结构；②加入适宜辅料。蛋白类药物的稳定剂有以下几类：

1.缓冲液

2.表面活性剂6.大分子化合物

3.糖和多元醇7.组氨酸、甘氨酸、

4.盐类赖氨酸的盐酸盐等

5.聚乙二醇8.金属离子24缓冲液pH对多肽、蛋白质药物的稳定性和溶解度均有重要的影响。在较强的酸、碱性条件下多肽、蛋白质药物容易发生化学结构的改变，在不同的pH条件下多肽、蛋白质药物还可发生构象的可逆或不可逆改变(聚集、沉淀、吸附或变性)多肽、蛋白质药物在pH4-10的范围内是比较稳定的。常用磷酸盐缓冲液,枸橼酸盐缓冲液25表面活性剂含长链脂肪酸的表面活性剂或离子型的表面活性剂(如十二烷基硫酸钠等)可引起蛋白质的解离或变性。少量的非离子型的表面活性剂(主要是聚山梨酯类)具有防止蛋白质聚集的作用。可能的机理是表面活性剂倾向性地分布于气／液或液／液界面，防止蛋白质在界面的变性等。26盐类无机离子可能够提高蛋白质高级结构的稳定性，也可能降低蛋白质高级结构的稳定性，取决于盐的种类、浓度、离子相互作用的性质及蛋白质的电荷。在多肽、蛋白质药物的溶液型注射剂中常用的盐类有NaCl和KCl等。27（三）蛋白质药物冻干制剂的稳定性与工艺在一些蛋白质药物不能采用溶液型制剂时，往往用冷冻干燥与喷雾干燥的工艺解决这类制剂的稳定性问题，这两种工艺均可用于蛋白类药物的脱水以延缓溶液中常见的分解作用。冻干制剂为不定形粉末的饼状物时，往往含水量适当，加水时溶解迅速而且澄清度好。28冷冻干燥蛋白质药物制剂冷冻干燥制备蛋白质类药物制剂主要考虑两个问题：选择适宜的辅料，优化蛋白质药物在干燥状态下的长期稳定性。考虑辅料对冷冻干燥过程一些参数的影响，如最高与最低干燥温度，干燥时间，冷冻干燥产品的外观等。29蛋白质药物在冻干过程中可能失去活性的原因:从液态到固态的相变过程中，包在蛋白质周围的水分子被除去而失活；高浓度的盐和缓冲组分的结晶或缓冲液pKa对温度敏感而导致pH变化、浓缩时蛋白质有限的溶解度等均能导致蛋白质药物失活。在选择冻干制剂的缓冲体系时，要考虑到温度对pH值和溶解度的影响。30冷冻干燥注意事项冻干保护剂:可改善产品的外观和稳定性，如甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、右旋糖酐等。预冻:一般应尽快将温度降至Tg以下;含水量:过多会影响药物稳定性或引起制剂的塌陷；而干燥过度可能使多肽、蛋白质药物的极性基团暴露(一般认为蛋白质分子被单层水分子包围时最稳定)，因此应加以控制(一般在3％左右)。31（二）喷雾干燥蛋白质药物制剂喷雾干燥的特点是所得产品可以控制颗粒大小与形状，生产出流动性很好的球状颗粒此项工艺对制备蛋白质类药物的控释制剂特别是发展新的给药系统是很有用的。在喷雾干燥过程中也可加入稳定剂。喷雾干燥的缺点是操作过程中损失大，特别是小规模生产，水分含量高。32四、蛋白质类药物新型的给药系统应用的生物可降解材料有聚乳酸（PLA）或聚乳酸乙醇酸共聚物（PLGA），改变丙交酯与乙交酯的比例或分子量，可得到不同时间生物降解性质的缓释微球。通过控制蛋白质进入血流的释放速度，从而达到延长蛋白质类药物血浆半衰期的目的。（一）缓释微球制剂33部分已上市缓释微球注射剂

药物/商品名制剂生产厂家曲普瑞林tiptorelin(Decapeptyl达必佳)微球德国FERRING戈舍瑞林goserelin(Zoladex)微球英国ZENICA亮丙瑞林leuprorelin(Enantone抑那通)微球日本武田生长激素somatropin微球美国ALMES促黄体激素释放因子的类似物，这类长效注射剂用于治疗子宫内膜异位、子宫肌瘤、性早熟及前列腺癌、乳腺癌等激素依赖性疾病。常规注射剂需每日给药，一个治疗周期约为3～6月；而微球注射剂在体内可缓释药物达1个月，至数月时间。

34复乳液中干燥法低温喷雾提取法喷雾干燥法超临界萃取法常用于制备多肽、蛋白质等生物大分子药物微球的方法：35一些疫苗全程免疫至少进行三次接种，才能确证免疫效果，但目前辍种率达70%。为了提高免疫接种的覆盖率，减少一些重大疾病的死亡率，世界卫生组织提出项目：疫苗脉冲式给药系统。疫苗脉冲式给药系统的目标：一次注射该制剂在1-14天，1-2月与9-12月分三次释药。(二)脉冲式给药制剂36（三）非注射给药给药制剂蛋白质和多肽类药物非注射途径包括鼻腔、口服、直肠、口腔、透皮、眼内和肺部给药，其中鼻腔似乎最有前景，蛋白质类药物非注射途经系统存在的主要问题是药物穿透粘膜能力差，易受酶的降解，以至生物利用度很低。37为了提高这类药物制剂的生物利用度，一般采用以下方法：

(1)对药物进行化学修饰或制成前体药物；

(2)应用吸收促进剂；

(3)使用酶抑制剂；

(4)采用离子电渗法皮肤给药。

38吸收促进剂作用机制：(1)增强药物的热力学运动，使药物不易聚集，溶解性增加，易于吸收；(2)改变上皮细胞的体积，使细胞间转运更易进行；(3)增加生物膜的流动性，使药物容易穿过，或引起膜磷酯排列的混乱或是促进膜中蛋白的沥滤；(4)抑制药物的水解。39鼻腔给药系统鼻腔粘膜中动静脉和毛细淋巴管分布十分丰富鼻腔呼吸区细胞表面具有大量微小绒毛鼻腔粘膜的穿透性较高而酶相对较少提高蛋白质类药物鼻腔给药的生物利用度，可采用吸收促进剂。40口服给药系统蛋白质类口服给药主要存在的问题：

(1)在胃内酸催化降解；

(2)在胃肠道内的酶水解；

(3)对胃肠道粘膜的透过性差；

(4)在肝的首过效应。41蛋白质类口服给药主要剂型：

微乳制剂；纳米囊；肠溶软胶囊；微球制剂；脂质体等。42直肠给药系统直肠内水解酶活性比胃肠道低pH接近中性药物吸收后可避免肝的首过效应。43口腔粘膜给药系统口腔粘膜较鼻腔粘膜厚，但无角质层面颊部血管丰富，药物吸收后可经颈静脉、上腔静脉直接进入全身避免胃肠消化液降解和肝的首过效应44经皮给药系统皮肤的穿透性低是多肽和蛋白质药物经皮吸收的主要障碍，但皮肤的水解酶活性相当低，为多肽和蛋白质药物经皮吸收创造了有利条件。离子导入技术使大分子量、荷电和亲水性的多肽和蛋白质类药物能透过皮肤角质层。45肺部给药系统目前肺部给药系统存在的主要问题：

(1)长期给药后安全性评估；

(2)肺吸收分子大小的限制；

(3)促进吸收的措施；

(4)稳定的蛋白质药物的处方设计等。46五、蛋白质类药物制剂的评价制剂中药物的含量测定；紫外分光光度法反相高效液相色谱法制剂中药物的活性测定；酶连免疫法放射免疫测定法47制剂中药物的体外释药速率测定；考虑到药物在溶出介质中不稳定，多采用测定制剂中未释放药物量的方法制剂的稳定性研究；物理稳定性：聚集化学稳定性：降解生物稳定性：生物活性测定。

48体内药动学研究；放射标记法测定血浆中药物的量反相高效液相色谱法刺激性和生物相容性研究；皮肤、粘膜及各类腔道用药需进行局部毒性和刺激性试验，各类注射（植入）途径给药剂型除进行局部毒性和刺激性试验外还需进行所用辅料的生物相容性研究，49生物技术药物：是指利用生物技术制备的药物。生物技术药物的特点：分子靶向性、药理活性强、剂量小、稳定性差、口服吸收差、半衰期短稳定性：化学稳定性、物理稳定性稳定化措施：磁改造其结构、加入适宜辅料总结50名词解释（20分）选择题（20分）简答题（30