急性和慢性帕金森病大鼠血脑屏障通透性变化的研究

急性和慢性帕金森病大鼠血脑屏障通透性变化的研究【摘要】目的通过观察帕金森病大鼠在不同时间点脑组织中伊文斯蓝(EB)含量变化来探讨急性和慢性PD大鼠血脑屏障通透性的变化。方法脑立体定向将6羟基多巴胺注入大鼠右侧纹状体建立PD模型。将大鼠随机分成对照组和模型组，后者又分为6h，12h，24h，4周组，最后一组为慢性PD组。按BELAYEV法使用EB测定BBB通透性。结果急性PD大鼠BBB通透性在6h达到高峰，12h逐渐下降，持续至24h，慢性PD大鼠与对照组相比无明显差异。结论急性PD时伴有BBB的通透性增加，而慢性PD时BBB的通透性未见改变。

【关键词】帕金森病；血脑屏障；伊文斯蓝

Abstract：ObjectiveTostudythealterationofblood-brainbarrier(BBB)withparkinsondiseasemeasuredbyEBcontentinthebraintissueofratswithacuteandchronicparkinsonparkinsondiseasemodelwasestablishedbydirectinjectionof6-OHDAintotherightstriatumratswererandomlydividedintocontrolgroupandmodelratsinmodelgroupwerekilledathour6,hour12,hour24andweeklastgroupwaschronicparkinsonDiseaseratBBBpermeabilitywasassessedbyBelyaev‘sBBBpermeabilityreachedthepeakathour6after6-OHDAacutelesion,thendecreasedathour12,lasteduntil24h.TheBBBpermeabilityofchronicparkinsondiseaseratshadnosignificantdifferenceascomparedwithcontrolgroup.ConclusionThepermeabilityofBBBwillincreaseinacuteparkinsondiseaseratsbuthasnochangeinchronicityparkinsondiseaserats.

Keywords：ParkinsonDisease;Blood-brainbarrier;EvensBlue

帕金森病是一种常见的中老年性疾病，主要病理学特征是中脑黑质部位多巴胺(dopamine，DA)能神经元变性死亡［1］，引起纹状体内DA递质含量显着降低。6羟基多巴胺作为DA神经元的化学切断剂，注入脑内可引起DA神经细胞急性损伤致DA含量下降。短期应用可致急性PD模型，长期应用可制作慢性PD模型。我们将6OHDA注入鼠脑右侧纹状体分别建立急性和慢性PD模型，通过测量伤侧脑组织伊文斯蓝(EvensBlue，EB)含量来观察血脑屏障通透性的改变，以探讨BBB的改变在急性和慢性PD发生中的作用。

1仪器与材料1仪器和试剂脑立体定位仪，牙科钻，VarioskanFlash型酶标仪，HM202型十万分之一天平，HHS精密电热恒温水浴锅(江苏金坛市医疗仪器厂)，高速冷冻离心机；6OHDA(sigma公司)，阿朴吗啡(sigma公司)，甲酰胺，伊文斯蓝(上海新中化学厂生产)，Millipore超纯水系统。2动物分组健康雄性Wistar大鼠，体重220～250g室温20～25℃,湿度50%～70%饲养，白天-黑夜分别12h睡眠和活动，自由进食、饮水。随机分为对照组和模型组，后者按损伤后不同观察时相点又分为6h，12h，24h，4周组。每组6只。

2方法

动物模型制作实验鼠用%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，固定于脑立体定位仪上，齿杆较耳杆低约mm。头皮正中切口约6cm，剥离骨膜，暴露前囟。定位方法依据Paxinos＆Watson所着《TheRatBraininStereotaxicCoordinates》找到前囟。在右侧纹状体钻一直径为1mm的小孔，用固定于立体定位仪上的微量注射器延针孔垂直进针。模型组：用10μl微量注射器抽取6μl6OHDA注入右侧纹状体内，注射速度μl/min，进药后留针15min，退针5min。缝合头皮，腹腔注射庆大霉素以预防感染。对照组：接受同样位点的注射，注射生理盐水6μl，其他过程同模型组。术后放回笼中，单笼饲养，常规饲料，自由进食、饮水。

行为学检测筛选慢性PD模型第4组实验鼠术后第2周开始经皮下注射新鲜配制的阿朴吗啡，检测大鼠旋转行为。每周1次，直至术后4周。手动记数每分钟旋转次数及30min内旋转总次数。恒定向损伤对侧旋转且旋转圈数超过7r/min的大鼠视为阳性，连续4周阳性者为合格的慢性PD动物模型。

伊文斯蓝测定实验鼠在相应的时间点麻醉后，经股静脉注入2%EB生理盐水溶液,几秒钟后大鼠眼球、结膜、四肢等均显示蓝色，表明注入成功。2h后快速开胸暴露心脏，迅速穿刺左心室后剪右心耳一小孔，用37℃生理盐水灌注致右心耳流出无色清亮液体，以清除血液中的染料，断头取脑，取损伤侧半球。用甲酰胺消化法测脑组织中EB含量：取损伤侧脑半球组织标本，称湿重后置于盛有3ml的甲酰胺试管中，60℃恒温水浴箱中孵育48h，使脑组织中的EB充分溶解在甲酰胺溶液中。将溶有EB的甲酰胺溶液3000r/min离心15min,取上清液，用酶标仪在EB最大吸收光谱630nm处测其光密度值。BBB通透性用每克组织中含有EB的含量表示相关系数r=5,其相关和回归效果均非常显着，绘出标准曲线。

统计学处理数据用±s表示。采用软件，组间比较用t检验，多组比较用方差分析。α=为检验标准。

3结果

行为学观察第4组实验鼠在术后第2周开始，皮下注射阿朴吗啡后2min左右，大鼠即开始向损伤对侧旋转且速度7r/min，身体向左屈成环状，头尾衔接，以右侧后肢为支点，伴觅食样动作。并且出现尾僵直、竖毛，头、身体向左侧偏斜。

EB定量检测结果如表1显示，与对照组相比，急性PD大鼠损侧半球的EB含量在6h显着增加并且达到高峰()，之后逐渐降低，持续至24h时仍显着高于对照组。而4周后即慢性PD大鼠损侧半球的EB含量未见增加，与对照组比较无显着差异。

表1损伤侧脑组织EB含量的变化

与对照组比较，*P＜，**P＜；n=7

4讨论

PD大鼠模型分为急性损伤模型和慢性损伤模型［2］。急性损伤模型常用的方法是将6OHDA注射至黑质、纹状体或者内侧前脑束,使DA能神经元在数小时内快速的死亡。这种急性损伤模型一般都是伴随慢性损伤模型制作过程中出现,多应用于神经组织移植和基因治疗研究中［3］。慢性损伤模型制作方法与前者相同，DA能神经元的快速损伤后持续至数周并且伴有行为学的变化,被用来模拟PD的慢性病程［4］。

BBB是由脑微血管内皮细胞、内皮细胞之间的紧密连接、基膜以及毛细血管周围的胶质细胞足突构成［5］，其中内皮细胞及紧密连接是BBB的重要形态学基础。BBB的特殊的结构使得98%的小分子化合物和几乎全部的大分子都不能透过大脑［6］，从而保持稳定的内环境。目前脑或CNS疾病已经成为严重威胁人类健康的一种疾病，PD病因不明、发病机制复杂，近几年的研究表明，加速老化、线粒体能量代谢障碍［7］、自由基的形成［8］、炎性介质和NO的释放在PD发病中起着重要作用，而诸如自由基、一些炎性介质和NO等血管活性物质的释放可能增加了BBB的通透性，打破了稳定的脑内环境。

本实验采用分光光度计法检测渗入脑组织中EB含量，定量评价了急性和慢性PD时血脑屏障的损害程度。研究表明，6OHDA所致急性PD大鼠BBB的通透性在6h增加并达到高峰，之后呈下降趋势，持续至24h仍有明显的增加。而经过行为学筛选的慢性PD大鼠BBB的通透性未发生改变。结合以往研究分析，初步认为6-OHDA急性损伤时释放了一些致炎物质，由于致炎细胞因子的上调，促使中性粒细胞粘附到血管壁，导致脑微血管内皮细胞及基底膜损害，使BBB的通透性增加。其次过量自由基的释放可导致脂质、蛋白质及核酸过氧化，过氧化物损害了脑血管壁，破坏了BBB完整性。而慢性PD模型历时较长，经过4周的时间曾经打开过的BBB又关闭，因此只能检测到极少量EB的渗入，但与对照组比较无统计学差异。

综上所述，BBB损伤受多因素、多环节之间的相互作用，互为因果，形成恶性循环。因此保护BBB的完整性可能是减轻6-OHDA急性损伤的重要措施。深入研究在急性PD时造成BBB损伤的各种机理，从不同的环节干预该病的病理过程，期望找到新的靶点并研发出有效的治疗药物，为PD的治疗开拓新的应用前景。

【参考文献】

［1］KimJ，InoueK，IshiiJ，eta1．AMicroRNAfeedbackcircuitinmidbraindopamineneu-rons［J］.Science，2007，317(5842)：1220.

［2］牛朝诗，李健.立体定向技术注射6-OHDA至内侧前脑束建立帕金森病大鼠模型［J］.立体定向和功能性神经外科杂志，2007，20：19.

［3］CarmanLS,GageFH,Shultslesionofthesubstantianigra:relationbetweenextentoflesionandrotationalbehavior［J］.BrainRes,1991,553(2):275.

［4］师长宏，周少波.帕金森病和L-DOPA诱导的运动障碍动物模型［J］.中国实验动物学杂志，2002，12：254.

［5］李金辉，万海同.脑缺血血脑屏障损伤分子机制及中医药防治研究近况［J］.浙江中医药大学学报，2008，32：127.

［6］