药物分析 第四章生物碱类药物的分析20150606

姚美村中山大学药学院第四章生物碱类药物的分析

Analysisofalkaloidsdrugs目的和要求（Objectives）1、掌握生物碱类药物的结构特征；掌握非水酸碱滴定法、提取酸碱滴定法；2、熟悉生物碱类药物的鉴别、纯度检查及有关物质分析方法原理与应用；3、了解其他定量方法和生物碱的体内样品分析。YaoMeicun,TelEmail:Lssymc@主要内容

(Contents)结构与性质1鉴别试验及检查分析2含量测定3体内药物分析4发展现状5思考题/重点内容6第一节、概述（Introduction）生物碱(alkaloids)是一类存在于生物体内的含氮有机化合物，因多数具有碱性，故称为生物碱其多存在于植物体内，少数存在动物体内，如蟾蜍碱（bufotenine）。Famous生物碱YaoMeicun,TelEmail:Lssymc@

第二节结构与性质

Structureandproperties一、分类(Classification)

按植物来源分类如苦参碱、（matrine）罂粟碱（papaverine）按生源结合化学骨架分类源于氨基酸途径和来源于异戊烯途径根据化学结构中的基本母核分类

（本教材选用）主要有六大类，即苯烃胺类、托烷类、喹啉类、异喹啉类、吲哚类、黄嘌呤类

分类方法1、苯烃胺类：氮原子不在环状结构内。如麻黄碱、伪麻黄碱、秋水仙碱

二、典型药物的结构及其特征（Structureandpropertiesofclassicaldrugs）

麻黄碱pKa=9.56

**氨基醇结构，可以与双缩脲试液反应，用于鉴别特点：①苯烃胺，仲胺，碱性较强，易与酸成盐。②氨基醇，与双缩脲反应。③芳环，UV。④不对称碳原子，旋光性。2.托烷类（莨菪烷类）莨菪烷衍生的氨基醇和不同有机酸缩合成酯类的生物碱，如硫酸阿托品、氢溴酸山莨菪碱、氢溴酸东莨菪碱硫酸阿托品脂环胺pKb=4.35特点：①酯结构，易水解②五元脂环,叔胺，碱性较强，易与酸成盐③不对称碳原子，呈左旋体阿托品为消旋体，无旋光性。奎宁（左旋体）奎尼丁（右旋体）(喹啉环）（喹核碱）(喹啉环）（喹核碱）

典型药物的结构

3.喹啉类药物

硫酸奎宁、硫酸奎尼丁、喜树碱等碱性:>pKb1=5.07pKb2=9.7pKb1=5.4pKb2=10特点：①碱性：喹啉环、喹核碱两部分，喹核碱含脂环氮，碱性强，可以与硫酸成盐；喹啉环系芳环氮，碱性较弱，不能与硫酸成盐②旋光性：奎宁和奎尼丁的分子式完全相同，但喹核碱部分立体结构不同，因此其旋光性、碱性和溶解性能也不同。奎宁为左旋体，奎尼丁为右旋体，奎宁的碱性大于奎尼丁。4.异喹啉类

盐酸吗啡、磷酸可待因盐酸吗啡（两性）脂环胺pKb=6.13pKa=9.85特点：

①碱性：吗啡:酚羟基、叔胺，故属两性化合物，碱性略强，即可以溶与氢氧化钠又可溶与盐酸水溶液。②可待因分子中仅有叔胺基团，无酚羟基，碱性较吗啡稍强，不能溶与氢氧化钠溶液。5.吲哚类硝酸士的宁、利血平硝酸士的宁pKb1=6.0pKb2=11.7利血平pKb1=7.93特点：

①碱性：士的宁和利血平结构中均含有两个碱性强弱不同的氮原子，士的宁结构中的吲哚氮由于与芳香环共轭，氮上的电子云密度小，几乎无碱性，脂环叔胺氮碱性较强可与一分子硝酸成盐。②利血平脂环叔胺氮由于受立体效应的影响，碱性较弱，不能与酸形成稳定的盐，而以游离状态存在。利血平具有酯结构，与弱碱接触或受热易水解。6.黄嘌呤类

咖啡因、茶碱咪唑嘧啶特性：咖啡因和茶碱是咪唑和嘧啶，分子结构中虽含有四个氮原子，但两个氮原子受邻位吸电子基团羰基的影响，几乎不呈碱性，而与其结构相似的茶碱具有酸性，可溶于碱的水溶液中H茶碱三、理化性质

Physicalandchemicalproperties1、性状

组成多数含有C、H、O、N，少数含有S、Cl

形态

多为结晶性固体，有些为非晶性粉末，少数为液体(如烟碱、槟榔碱)味多具苦味(盐酸小檗碱)，少数呈辛辣味

颜色

一般无色或白色；少数具有长链共轭体系的具有一定颜色。如，小檗碱：黄色；小檗红碱：红色；一叶萩碱：淡黄色挥发性与升华性少数液体及个别小分子生物碱具挥发性(麻黄碱)，少数具升华性(咖啡因)产生原因N原子具有孤对电子，能接受质子或给出电子而显碱性理论依据表示方法pKa碱性大小与pKa关系pKa＜2为极弱碱，pKa2～7为弱碱pKa7～11为中强碱，pKa11以上为强碱碱性基团pKa值顺序胍基＞季胺碱＞N-烷杂环＞脂肪胺＞芳香胺≈N-芳杂环＞酰胺≈吡咯2、生物碱的碱性共轭酸碱概念及强度表示杂化方式诱导效应共轭效应空间效应氢键效应碱性与分子结构的关系碱性类型杂化示例脂肪胺脂氮环sp3

11.311.29.5芳杂环sp2

0.45.174.945.14氰基sp－C≡N1）杂化方式

甲基苯环2）诱导效应

氨基其他烷基酰基,双键羟基,醚氧供电子基吸电子基碱性增强碱性减弱苯胺型酰胺型烯胺型N原子上孤对电子形成p-π共轭时，碱性减弱3）共轭效应稀胺型特例：N原子α,β-位有双键可能转化为季铵蛇根碱

（serpentine）pka10.8pka8.2pka5.6pka3.8strychninepseudostrychnineneostrychnineN:处在桥头，为刚性结构，不发生未共用电子对的转移，故不形成季铵碱。4）空间效应生物碱的共轭酸盐若能生成稳定的分子内氢键（与含氧基团），则碱性增强。和钩藤碱

pka6.32

异和钩藤碱

pka5.20

5）氢键效应第二节鉴别试验及检查分析

IdentificationandPurificationanalysis

1．熔点和衍生物熔点，

2．比旋度

一、鉴别试验(Identificationtest)

（一）测定物理常数ChP(2010)Themeltingpointandrotationofalkaloiddrugs药物名称熔点℃比旋度[α]D盐酸麻黄碱盐酸伪麻黄碱秋水仙碱氢溴酸东莨菪碱氢溴酸山莨菪碱硝酸毛果芸香碱磷酸可待因217~220183~186148~153195~199176~181174~178155~159-33°至-35.5°,50mg/ml,H2O+61.0°至+62.5°,50mg/ml,H2O-425°至-450°,100mg/ml,H2O-24°至-27°,50mg/ml,H2O-9.0°至-11.5°,0.1g/ml,H2O+80°至+83°,0.10g/ml,H2O-98°至-102°，2%，H2O一般鉴别反应1、显色反应磷钼酸试剂（Frohd试剂）、钒硫酸试剂（Mandelin试剂）、甲醛硫酸试剂（Marguis试剂）、亚硒酸硫酸试剂（Meclce试剂）、对二甲氨基苯甲醛试剂（Wasicky试剂）硫酸铈铵的磷酸试剂、硫酸、硝酸等（二）化学反应鉴别法ChP(2010)GeneralcolorreactionofSomealkaloiddrugs药物名称显色反应结果马来酸麦角新碱1mg,加水溶解后，加对二甲苯氨基苯甲醛试剂2ml，5min后显浅蓝色利血平1mg,加0.1%磷钼酸钠的硫酸溶液0.3ml，即显黄色。5min后变为蓝色盐酸婴粟碱5mg,加甲醛硫酸试液1ml，溶液无色或显淡黄色，渐变深玫瑰红色，最后变为紫色。（吗啡或吗啡的酯化物即呈紫色或紫堇色）硫酸长春新碱0.1mg，加1%硫酸铈铵的磷酸溶液1滴，即显紫红色硫酸长春碱0.1mg，加1%硫酸铈铵的磷酸溶液2～3滴，即显蓝色，放置后渐变为紫堇色磷酸可待因1mg,于白瓷板上，加含亚硒酸2.5mg的硫酸0.5ml，即显绿色，渐变蓝色示例显色机制很复杂，涉及脱水、氧化、缩合等过程。生成不溶性盐类:硅钨酸、苦味酸、磷钼酸试剂等生成疏松的配合物:碘-碘化钾试剂生成不溶性加成物：碘化铋钾、碘化汞钾等重金属盐类沉淀试剂2.沉淀反应在酸性水溶液中，与生物碱沉淀试剂（重金属盐类和大分子酸类等）发生沉淀反应。试剂名称组成反应特征碘化物复盐类碘-碘化钾试剂

KII2红棕色沉淀碘化汞钾试剂

K2HgI4类白色沉淀碘化铋钾试剂

KBiI4黄至橘红色沉淀重金属盐类

硅钨酸试剂

SiO212WO3nH2O淡黄或灰白色沉淀

磷钼酸试剂H3PO412MO32H2O白色或黄褐色沉淀示例

特征鉴别反应

1.

双缩脲反应氨基醇结构的反应

水层蓝色醚层紫红OH-乙醚2.Vitali反应托烷生物碱反应△黄色深紫色3.绿奎宁（Thakkeioquin）反应含氧喹啉的反应

H+翠绿色氨水4.紫脲酸胺反应黄嘌啉类生物碱

5.异喹啉类生物碱的特征反应（1）Marquis反应含酚羟基异喹啉特征反应

紫堇色盐酸乙基吗啡

→黄色紫色黑色¾¾®¾-硫酸甲醛盐酸阿朴吗啡

黑色

紫堇色®→→紫色¾¾¾¾®¾-硫酸甲醛磷酸可待因（2）Frohde反应盐酸吗啡+钼硫酸→→→紫色蓝色棕绿色（3）还原反应吗啡的弱还原性

吗啡与磷酸可待因的区分反应6.吲哚类生物碱的特征反应---官能团反应

（1）与香草醛反应（2）对二甲氨基苯甲醛反应利血平+新制香草醛→玫瑰红色（三）物理化学鉴别法

光谱鉴别法

1．UV吸收光谱

a.

比较最大（小）吸收波长和相应的吸收度

b.

与对照品比较吸收光谱的一致性

c.

比较吸光度或吸收系数的比值2．IR吸收光谱IR光谱信息丰富，准确度高，专属性强YaoMeicun,TelEmail:Lssymc@

第三节含量测定

assay一、非水溶液酸碱滴定法

(Nonaqueousacid-basetitration)本类药物在水中碱性较弱（滴定突跃不明显，难以判断滴定终点），很难直接滴定。在酸性非水介质中（如冰醋酸中），碱性显著增强，滴定突跃增大，可用高氯酸滴定液直接滴定，以指示剂或电位法确定终点。（一）基本原理生物碱少数以游离状态存在，多数盐形式存在。置换反应，即用强酸（HClO4）置换出与生物碱结合的弱酸（HA）HA不同，对滴定反应的影响也不同BH+·A-代表生物碱盐类

HA弱酸有机酸：马来酸无机酸：HCl、H2SO4、HNO3、H3PO4、HBrHClO4、HBr、HCl、H2SO4、HNO3在水中酸强度相等在冰醋酸中酸强度不相同HClO4＞HBr＞H2SO4＞

HCl＞HNO3＞其它弱酸(二）方法与应用本法为半微量分析方法：滴定剂：0.1mol/LHClO4/无水gHAc溶液，消耗约8ml空白试验消耗：1~3D，20D→1ml，1D→0.05ml使用10ml滴定管方可读出，以减小误差1.方法2．测定条件的选择Kb<10-8(含氮有机碱盐及游离含氮有机碱）马来酸氢卤酸盐硫酸盐硝酸盐磷酸盐适用范围溶剂选择药物Kb合适的溶剂Kb=10-8~10-10

冰醋酸Kb=10-10~10-12冰醋酸+醋酐Kb﹤10-12醋酐溶剂一般用量10~30ml确定终点方法选择指示剂法最常用的指示剂是结晶紫（CrystalViolet，CV）（碱性区）（酸性区）

终点的颜色应用电位法校准。紫蓝蓝绿黄绿黄绿b·电位法3.注意事项a.

水份的影响及排除gHAc和HClO4中都含有一定量的水份

排除法：配制时，根据gHAc和HClO4含水量，加入计算量的醋酐费休氏（Fischer）水分测定法准确测出gHAc和HClO4中含水量，准确加入醋酐b.

标准溶液的稳定性

水的膨胀系数是0.21×10-3/CgHAc膨胀系数是1.1×10-3/C，较大，体积随温度变化较大，且还具有挥发性测定样品与标定标准溶液时温度不同，应对浓度进行校正。其中：

0.0011：gHAc的膨胀系数t0和t1：标定标准溶液和测定样品时的温度F0和F1：t0和t1所对应的标准溶液的浓度说明：

①t1-t0<2C

直接使用

②

2C<t1-t0<10C

公式校正

③t1-t0>10C，或超过30天，重新配制标定校正公式：c.空白试验消除试剂对终点的影响应用示例1.游离生物碱测定咖啡因0.15g醋酐-冰醋酸5：1CV1DHClO4(0.1mol/L）黄色2.

氢卤酸盐的测定氢卤酸在gHAc中酸性较强，对滴定有影响。排除方法：加入过量的HgAc2/gHAc溶液（理论量1～3倍）

由于醋酸汞毒性较大，Ch.P(2010)大多数生物碱氢卤酸盐的测定取消醋酸汞，改为电位法指示终点盐酸麻黄碱冰醋酸10mlHg(AC)24ml结晶紫1DHClO4(0.1mol/L）滴定翠绿色百分含量=生物碱的硫酸盐，在冰醋酸介质中只能被滴定至生物碱的硫酸氢盐。3.硫酸盐的测定（1）硫酸阿托品的测定

HClO4直接滴定时，反应摩尔比为1∶1（2）硫酸奎宁的测定分子中有四个N原子二个喹啉N，属于芳环族N，碱性较弱二个喹核N，属于脂环族N，碱性较强滴定反应如下：+3HClO4+用HClO4直接滴定硫酸喹宁时，摩尔比是1∶3在水中硫酸是二元酸，能够解离出两个氢离子，即在冰醋酸中硫酸是一元酸，解离出一个氢离子，即奎宁与硫酸结合时，一分子的硫酸能与两分子的奎宁结合，即：（3）硫酸奎宁片的含量测定经过处理排除辅料对测定的影响方法：10片→去糖衣→精称总重→研细→精密称取W（≈相当于硫酸奎宁0.3g）→加0.1mol/LNaOH10mlCHCl3液HClO4（0.1mol/L）滴定CHCl3提取醋酐除水原理：中和游离碱HClO4二甲基黄玫瑰红醋酐摩尔比标示百分含量%=×100%（V-V0）TFW×标示量

因HNO3具有氧化性，可使指示剂变色，一般电位法指示终点。如硝酸士的宁、硝酸毛果芸香碱

4.硝酸盐的测定

弱酸，对滴定无干扰，能准确滴定，按常法测定，如磷酸氯喹、磷酸可待因5.磷酸盐和有机酸盐的测定简便、快速、准确、取样量小，测定的是生理活性部分，尤其适合原料；专一性差，实际上是置换滴定，滴定阴离子。小结（一）基本原理

利用生物碱盐类可溶于水，游离生物碱不溶于水而溶于有机溶剂的性质进行提取，然后进行滴定的方法。

二、提取酸碱滴定法

(Extractionacid-basetitration)

生物碱盐类可溶解于水，不溶于有机溶剂游离生物碱不溶于水，易溶于有机溶剂依据性质（二）操作步骤与方法测定方法1.直接滴定法用于碱性较强的生物碱

2.剩余滴定法用于碱性较弱的生物碱

3.酸滴定液返提后剩余滴定法用于对热不稳定的生物碱

1.碱化试剂①选用碱化试剂时应考虑的因素碱化试剂碱性大于生物碱的碱性；不易进入有机相，或易除去；不与生物碱和有机溶剂反应；

（三）条件选择生物碱的化学性质易水解或具两性，不能用强碱试剂。如阿托品具有酯结构，与强碱接触时分解；吗啡有酚羟基，和NaOH形成酚盐溶于水，难以用有机溶剂提取。有脂肪性物质共存时，不能用强碱性的碱化试剂，以免形成乳化而难以用有机溶剂提取。

②氨水是最常用的碱化试剂特点：氨Kb=1.75×10-5（pKb为4.67）一般生物碱Kb：10-6~10-9（pKb为6～9）氨碱性适当，能使大部分生物碱游离，又不能使具酯结构或两性生物碱水解或成盐，具挥发性、易除去，对测定无干扰。2.提取溶剂（1）提取溶剂选择的原则（2）常用的提取溶剂：最常用氯仿氯仿特点：比重大，易于分离对大部分生物碱都有较大的溶解度不燃烧，使用安全氯仿在碱性下受热很容易分解，尤其是碱性较强时更容易分解。（3）提取溶剂的用量及提取次数通常应提取4次，第一次用量至少应为水液体积的一半，以后几次应各为第一次的一半3.提取终点的确定用合适的沉淀反应确定4.指示剂的选择滴定时选择变色范围在酸性区域的指示剂5.乳化的预防和消除预防乳化方法：a采用碱性弱的碱化剂b采用不易产生乳化的合适提取剂c在保证提取完全的条件下，避免过于猛烈的振摇消除乳的方法：a再加一些有机相或水相b加数滴乙醇并轻轻转动分液漏斗c轻度乳化可旋转分液漏斗，将已分出的液层分出，以加速分层速度。d用热毛巾在分液漏斗外热敷e以盐析破坏乳化F用脱脂棉过滤

（四）方法小结1.专一性：经分离后测定生物碱，有一定专一性。2.缺点：费时，繁琐；对挥发性或热不稳定性生物碱类药物不适用。三、紫外可见分光光度法

(Ultravioletvisiblespectrophotometry)（一）直接测定法通常选择λmax为测定波长，多用对照品比较法和吸收系数法。

（尖峰适合用最大吸收波长？）例ChP氨茶碱注射液的含量测定—吸收系数法

本品相当标示量的百分含量=式中，A为测得的吸光度值；n为稀释倍数；V为供试品取用量，ml。（二）酸性染料比色法1.基本原理在适当的pH介质中

（适用于小剂量药品及制剂）2.方法定量分取呈色有机相测定A()定量分取呈色有机相测定A()定量分取呈色有机相测定A()脱水脱水脱水碱化酸化3.实验条件选择关键：定量生成离子对，全部提取到有机相，提取常数大，提取完全。E－提取常数D－分配比，与所用酸性染料阴离子种类、溶剂有关。（1）酸性染料选择要求：a.能与有机碱定量结合；

b.形成离子对在有机相中有最大溶解度，在λmax处，A最大；c.酸性染料不得进入有机相。常用酸性染料：溴麝香草酚蓝(BTB)、溴甲酚绿(BCG)、溴酚蓝(BPB)溴麝香草酚蓝(BTB)bromthymolbluepH6.0~7.6（黄~蓝）常用酸性染料----磺酞类指示剂溴甲酚绿(BCG)bromcresolgreenpH3.6~5.2（黄~蓝）溴酚蓝(BPB)bromophenolbluepH3.8~4.6（黄~紫）

（2）有机溶剂的选择要求：