生物制药工艺学思考题及答案

抗生素发酵生产工艺青霉素发酵工艺的建立对抗生素工业有何意义？青霉素是发现最早，最卓越的一种B-内酰胺类抗生素，它是抗生素工业的首要产品，兰氏阴性菌无效。青霉素经过扩环后，形成头孢菌素母核，成为半合成头孢菌素的原料。如何根据青霉素生产菌特性进行发酵过程控制？青霉素在深层培养条件下，经历7个不同的时期，每个时期有其菌体形态特性，在规定时间取样，通过显镜检查这些形态变化，用于工程控制。第一期：分生孢子萌发，形成芽管，原生质未分化，具有小泡。第二期：菌丝繁殖，原生质体具有嗜碱性，类脂肪小颗粒。第三期：形成脂肪包含体，积累储蓄物，没有空洞，嗜碱性很强。素。第五期：形成大空泡，有中性染色大颗粒，菌丝呈桶状。脂肪包含体消失，青霉素产量提高。第六期：出现个别自溶细胞，细胞内无颗粒，仍然桶状，释放游离氨，pH上升。子。四到五期为生产期，生产能力最强，通过工艺措施，延长此期，获得高产。在第六期到来之前发束发酵。青霉素发酵工程的控制原理及其关键点是什么？控制原理：发酵过程需连续流加葡萄糖，硫酸铵以及前提物质苯乙酸盐，补糖率是最关响，如培养基，补充碳源，氮源，无机盐流加控制，添加前体等；控制适宜的温度和ph，菌体浓度。最后要注意消沫，影响呼吸代谢。青霉素提炼工艺中采用了哪些单元操作？艺包括如下单元操作：后续的分离纯化过程。②萃取：其原理是青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素易溶于水。③脱色：萃取液中添加活性炭，除去色素，热源，过滤，除去活性炭。溶液，青霉素钾盐可直接结晶析出。氨基酸发酵工艺如何对谷氨酸发酵工艺过程进行调控？发酵过程流加铵盐、尿素、氨水等氮源，补充NH4+；生物素适量控制在2-5μg/L；pH控制在中性或微碱性；供氧充足；磷酸盐适量。氨基酸生产菌有什么特性，为什么？L-谷氨酸发酵微生物的优良菌株多在棒状杆菌属L-谷氨酸。生物素在谷氨酸发酵过程中的作用是什么？生物素是不饱和脂肪酸合成过程中所需的乙酰CoA性，解除其对谷氨酸脱氢酶的抑制，源源不断生产谷氨酸。维生素发酵生产工艺比较分析现行维生素C现行的维生素c生产工艺过程有：莱氏化学合成法和两步发酵法。-葡萄糖为原料，进过催化氢化生成D为L-山梨糖，酸性液中丙酮化，对L--2-酮-L-古龙酸，除去丙酮，内酯化和烯醇化得到4两部发酵法：①催化氢化：催化氢化D-葡萄糖，控制压力，在氢做还原剂、镍做催化剂的条件下，将醛基还原成醇基，从而制备D-山梨醇。②第一部发酵：D-山梨醇C2位羟基氧化为羰基，其他基团不变，微生物转化得L-山梨糖。③第二部发酵：L-山梨糖到2-酮基-L-古龙酸需要将C1位醇基氧化为羧基，保持其他基团不发生变化。其中两步发酵法更具有优势。原因如下：①以生物氧化代替化学氧化简化了生产工艺。有利于安全生产。③三废和污染较小。④提高了生产能力。C维生素C分子中含有两个手性碳原子，故有四个光学异构体。其中L(+)-抗坏血酸括性最高，D（-）-异抗坏血酸活性仅为其20％，工业上将其作为食品抗氧剂。D(-)-抗坏血酸和L(+)-异抗坏血酸几乎无活性。在未来，一步发酵能取代两部发酵，成为维生素生产的主流工艺吗，为什么？一步法发酵对工业菌株的山梨醇/糖旁路代谢途径进行敲除。与原始菌株比较，发现单菌发酵24h后，培养基中剩余的山梨醇糖含量基本保持恒定，NSR缺失株相对于原始菌株残糖量提高了85.9%。基因工程制药工艺工程菌与宿主菌对培养基要求有何不同，为什么？类物质为碳源。大分子有机氮源；酵母利用氨基酸为氮源。常用氨基酸营养缺陷型。影响工程菌培养工艺的主要参数是什么？如何优化控制？pH：了解发酵过程中各个阶段的适宜pH以后，进一步设法控制pH在合适的范围内。分阶段控制pH：根据试验结果来确定生长最适pH和产物最适pH，以达到最佳生产。溶解氧：从供应量和需要量（菌体生长、质粒稳定性、产物积累）二个方面考虑，使之需氧不超过设备的供氧能力，在临界溶解氧浓度之上。诱导物对生长和产物合成有何影响，为什么？诱导物用来诱导表达型工程菌。在细胞生长到一定阶段，必需添加诱导物，以解除目标基因的抑制状态，活化基因，进行转录和翻译，生成产物。适宜的诱导时间非常重要。诱导物的浓度及其发酵温度会影响表达量和产物存在形式。化学诱导型启动子：lzc、tac、T7等，诱导时间为对数生长期。温度诱导型启动子：PL、PR等，诱导时间为对数期或稍后一些。基因工程制药工艺程原理是什么？（PCR（酶切、链接（外源基因导入与培养（）酶切：在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段（DNA+缓冲液+限制性内切酶；37℃，1小时；加热、加EDTA终止；电泳检查酶切完整性）双链上相邻的3’羟基和5’磷酸基团共价结合形成3’-5’磷酸二酯键，使原来断开的DNA缺口重新连接起来（10min）转化：把外源基因导入宿主细胞的过程（氯化钙法向大肠杆菌导入外源基因）目标基因克隆的主要方法有哪些？分析其特点及其适用范围①PCR扩增。优点：简便快速，高效，数kb单基因克隆。缺点：DNA聚合酶活性和保真性限制。（94℃变性→55℃退火→72℃延伸→94℃变性……）耗时，昂贵。③化学合成：简便，准确，已知序列基因克隆，引物合成。缺点：受合成仪性能限制，长度很短。大肠杆菌中高效表达蛋白药物着重设计哪几个方面？为了确保工程菌构建的有效性，必须遵循GMP及其有关生物制品研究技术指导原则，表达载体的构建、结构和遗传特性。②宿主细胞:详细记录宿主细胞的资料，包括细胞株系名称、来源、传代历史、鉴定结果及基本生物学特性等。③目标基因序列:目标基因的序列重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺路线有哪几条，有何缺点？①体外诱生干扰素制备工艺：仙台病毒诱导人白细胞：血浆→人白细胞（病毒诱导）→分离纯化→人白干扰素。缺点：产量低，1gIFNα需要105L人血白细胞，来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵，潜在的血源性病毒污染的可能性。②Namalva（病毒培养8000L。缺点：活性低，退出临床应用。③工程菌构建→发酵培养→包涵体→复性→重组人干扰素。工艺特点：发酵过程，随后变然没有摆脱潜在的传播血源性疾病的危险。分泌表达，产量低，成本高，过程控制严格。可以做到无血清培养。⑤基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺。工艺特点：发酵周期短：几个小时，无需变性、复性过程，获得有活性产品，纯化过程：淘汰抗体亲和层析，制剂中采用非人血清白蛋白新型保护剂，使得整个制造过程中不使用任何血液提取成分。重组人干扰素发酵工段的关键控制点是什么，如何实现最优化过程控制？①摇瓶培养：摇瓶培养：30℃，pH7.0，250rpm，16-20h；②种子罐培养：接种：接入50L种子罐，接种量10%培养：30℃，pH7.0控制：级联调节通气量和搅拌转速。干扰素纯化工艺的原理是什么？基于蛋白质的电荷性除去杂质，准确控制缓冲液和上样液的pH及电导值，纯化干扰素干扰素纯化工艺过程中各工段的目的是什么？①溶解粗干扰素：配置缓冲液（磷酸缓冲液，滤器和10ku超滤系统，百级层流下收集，冷却至②等点沉淀与疏水层析：磷酸调节至pH5.0，沉淀杂蛋白，离心收集上清液（扰素。用NaOH调节上清液pH7.0，并用5MNaCl调节溶液电导值180ms/cm，上样，进2-100.025M（pH7.0）+1.6MNaCl进行洗涤，除去非疏水性蛋白。用0.01M磷酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，干扰素。或②等电点沉淀与盐析：磷酸调节pH4.5，调节电导值40ms/cm，2-10℃静置过夜，1000ku超滤膜过滤，除去大蛋白。调整溶液pH8.0，10ku超滤膜，0.005M缓冲液。③阴离子交换层析与浓缩：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）平衡树脂，盐浓度线性梯度5~50ms/cm进行洗脱，2-10℃，配合SDS收集干扰素峰。把目标馏分合并，调整溶液pH和电导值，10ku超滤膜，0.05M醋酸缓冲液（5.0）中透析。④阳离子交换层析与浓缩：用0.1M醋酸缓冲液（pH0.5）平衡树脂。上样，相同缓冲液冲洗。盐浓度线性梯度5-50ms/cm进行洗脱，配合SDS收集干扰素峰。合并馏分，10ku超滤膜系统。NaCl的0.01M⑥无菌过滤分装：0.22μm膜过滤干扰素溶液，分装，-20℃以下的冰箱中保存。动物细胞培养制药工艺与制药有何关系？葡萄糖代谢：糖酵解为主，生成丙酮酸和乳酸。丙酮酸经TCA循环，氧化产生CO2和水，释放能量。葡萄糖一小部分进入PPP途径，生成4、5、7碳糖和NADPH。谷氨酰胺：作为氮源，转氨、脱氨（为主合成代谢的前体。氨基酸在粗糙内质网上的核糖体上，以mRNA为模板，进行密码翻译，生成蛋白质的细胞系糖基化特征不同，要根据药物的结构选择适宜细胞系。制药动物细胞系的种类和特点有哪些？e.g.2BS0代，鸡胚0代，小鼠8代）合于制药工业生产。人源细胞系：Namalwa，WI-38，MRC-5哺乳动物细胞系：CHO，贴壁或悬浮培养，对剪切力和渗透压有较高的忍受能力。BHK-21，C127，Vero杂交瘤细胞系：脾脏B细胞与骨髓瘤细胞通过原生质体融合，获得的杂交细胞。无血清培养，高密度悬浮生长，容易转染和生长，大量分泌和高效表达与大肠杆菌和酵母系统相比，哺乳动物源细胞系统制药的优缺点，如何选择？CHO细胞：Chinesehamsterovary2n=22。特点：BHK-21细胞，贴壁生长，适合于牛乳头病毒DNAVero细胞：多倍体核型，贴壁依赖性。Vero6最为常用，增至病毒，生产疫苗。它们与基因工程微生物的异同是什么？性？。氨基酸可通过生糖或生酮途径冲PH的变化。激素对细胞的生长有刺激作用。贴附因子的作用是让细胞的贴壁生长。生产用最适动物细胞培养基应该选择哪种，为什么？合成培养基，组分稳定，容易配置。已有几十种合成培养基，大部分已商品化如何控制动物细胞培养基的质量？培养用水质：必须按照GMP要求进行制备，除去普通水中的各类元素、有毒或有害物质及微生物和热源，达到纯水标准。缓冲液：H2CO3/NaCHO3；NaH2PO4/Na2HPO4；恒定pH。平衡盐溶液：BBS，由NaCl、无机盐和葡萄糖、缓冲剂、指示剂组成。满足细胞对盐离子、碳营养要求；pH和渗透压要求；直观观察pH。、KH2PO4NaCl。培养物、器皿✁洗涤液。倍浓缩液。使用L型氨基酸，对于DL倍。谷氨酰胺不稳定，需单独配置。基质依赖性与非依赖性细胞系对培养条件✁要求有什么不同？如何满足？然细胞。非贴壁依赖性细胞：不依赖于生长基质，可悬浮生长。淋巴细胞、杂交瘤细胞、肿瘤细胞。适量带正电荷，细胞被吸附在介质上。细胞大规模培养有几种方法，有何特点，如何选择应用？层细胞✁培养方法，适合于贴壁依赖性细胞培养。贴壁性依赖性细胞，如杂交瘤细胞。壁依赖性和非贴壁依赖性细胞。④微载体培养。微载体是三维培养系统，有很大✁比表面积，细胞贴附于载体上增值，再悬浮于细胞液中，兼具有贴壁和悬浮培养的双重优点。比较微生物发酵控制过程的异同动物细胞 微生物温度 在线，恒温，水套层，电热片， 三基点，发酵热对生长和生产影响加温 变温控制，降温搅拌，泡沫 低转速，加剪切保护剂，消沫剂 基于供氧与混合化学消沫剂与分散剂，机械消沫溶解氧CO2pH

临界氧浓度需要通入，调节pH恒定，缓冲剂，通气，补料，综合控制

供氧与耗氧的平衡，临界氧浓度之上尾气，呼吸强度三基点，变pH，加酸/碱；缓冲剂，补料代谢检测与分析 底物消耗，副产物生成，胞内谢，分泌补料 补充营养，控制代谢过程放料 解除副产物，收获产物

底物消耗，产物的生成，生物化学变化解除底物抑制，增加前体解除产物抑制重组人红细胞生成素的生产工艺rhEPO①SV40病毒✁动子的表达载体，在COS-1中瞬时表达hEPO。②昆虫SF9细胞中杆状病毒载体表达rhEPO。产率有所改善，糖基化程度较小。③家蚕系统表达，糖基化简单，药物在体内稳定性较低、活性较差等问题。④大肠杆菌表达，仅具体外抗原结合活性。⑤干扰素-α基因✁动子的rhEPO表达载体，BALL-1细胞，产生较高量的rhEPO。⑥CHO、BHK细胞中稳定表达，rhEPO与天然EPO结构、活性相似。CHOrhEPO①复苏：液氮冻存的CHO细胞系在37℃中水浴快速融化。无菌离心，弃上清。②培养：加适量小牛血清，37℃2培养箱培养，连续传三代。③消化：用胰蛋白酶消化贴壁细胞后，制成细胞浓度约为2.5×106个/ml。用于接种。④反应器灭菌：加纤维素载体片及pH7.0的PBS缓冲液，高压灭菌。⑤接种：排出S缓冲液，加M培养基（含％血清，接入种子细胞。⑥贴壁培养：pH7，<50r/min，37℃，DO50-80%。⑦扩增培养：80－100r/min。pH7，37℃。⑧灌流培养：控制温度、DO、pH值等培养条件，进行无血清培养基连续培养。⑨收获培养物：连续收获，4℃－8℃保存。控制点：①搅拌控制：接种后,搅拌速度缓慢，使细胞贴附于载体上，随着细胞数量的增加逐渐提高搅拌速度。②温度控制：较为严格，恒定37℃③pH值控制：7.2-7.4,输入CO2和碳酸氢盐溶液维持其恒定。④溶解氧控制：在50-80％的范围内，通入氧气、空气、氢气或氮气的比例混合气体。⑤葡萄糖控