霍奇金淋巴瘤实验设计课件

研究背景霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’slymphoma，HL，Hodgkin’sdisease，）是恶性淋巴瘤的一个独特类型。

研究背景其特点为：①临床上病变往往从一个或一组淋巴结开始，逐渐由邻近的淋巴结向远处扩散。原发于结外淋巴组织的少见。研究背景②瘤组织成分多样，但HL特异性的病理改变为——大量反应性增生的背景淋巴细胞中可见少于1%Reed-Sternberg细胞（R-S细胞）。这种特殊的瘤巨细胞来源于B淋巴细胞(镜影细胞)研究背景p53和bcl-2基因突变EB病毒感染但证据均不足，HL的发病机制尚未明确肿瘤细胞研究背景有研究发现NF-κB(RelA/P50)的组成性激活是霍奇金淋巴瘤细胞的特点。[1]IκBα作为重要的NF-κB通路抑制因子，在多种瘤细胞中表达量均减少。研究背景将对IκBα激酶（IκBαkinase,IKK）无反应的IκBα突变体导入HRS细胞中可阻断NF-κB的活化，导致细胞凋亡，说明IκBα在HL发病机制中有重要作用。[2]研究背景Emmerich等人的研究表明HRS细胞中IκBαmRNA高表达，但在蛋白水平检测的阳性强度弱，可能与HL中泛素化降解活性增强有关，也可能由IκBα蛋白结构改变导致。[3]用已知IκBα外显子PCR扩增阳性的标本为模板作阳性对照，用双蒸水作为阴性对照。但证据均不足，HL的发病机制RegulationofNF-kappaBactivitybyIkappaB-relatedproteinsinadenocarcinomacells[J].扩增第二外显子时加引物0．3μl，补所需ddH2O使反应体系达到50μI。巢式聚合酶链反应(nestedpolymearsechainreaction,nPCR)也称套式PCR。为了经济节约，可在第2轮扩增时采用半巢式，设计单条引物，另一条引物与第1轮扩增共用，。（蓝色-C,红色-T，绿色-A，黑色-G）EnVision两步法电泳条带在同一水平线上。Thankyou！这种特殊的瘤巨细胞来源于B淋巴细胞(镜影细胞)CD30单抗（Dako公司，克隆号Ber—H2，效价1：20）加相应的二抗，DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，充分水洗。[2]DejardinE,etal.如果片段在800以内，那么随便进行一个方向就能测出你全部的序列了DAKOEnVision显色系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即

EnVision）直接放大信号40-50倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’slymphoma，HL，Hodgkin’sdisease，）是恶性淋巴瘤的一个独特类型。扩增IκBα第三到第六外显子反应体系：Blood,1999,94(9):3129-34.PCR引物（北京赛百胜公司）研究目的本实验意在：①了解IκBα基因在HL中突变的情况；②分析经典型HLHRS中IκBα突变的特点、可能造成的蛋白结构异常；③以及这些异常的病理意义，即其与HL发病的相关性。实验材料与试剂霍奇金淋巴瘤组织样本CD30单抗（Dako公司，克隆号Ber—H2，效价1：20）LeicaASLMD激光显微系统PCR引物（北京赛百胜公司）PCR仪（包括反应体系）DNA测序仪实验流程CD30免疫组化激光显微切割和DNA提取IκBα基因扩增PCR产物检测待测基因外含子测序CD30免疫组化采用EnVision两步法。将冰冻组织切成6μm厚连续切片，贴于LeicaPEN膜空白切片上，用含0．05％NP40的丙酮(v／v)固定10min，室温下自然干燥；CD30免疫组化6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除内源性过氧化物酶；加1：20稀释的一抗；加相应的二抗，DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，充分水洗。激光显微切割和DNA提取用LeicaASLMD系统逐个切割组织切片上的CD30阳性细胞（切割参数：激光强度37，波长377，速度5，光束直径8）。将目的细胞从切片上分离，在光压强作用下被收集到离心管盖内，每例标本3～6组，每组约25～70个细胞。切割周围的正常淋巴细胞每例2管，每管约50个细胞。扩增目的基因，上游引物：5’-CACACTGTGCCCATCTACG-3’，下游引物：5’一GGTc1-ITI’GCGGATGTCCAC一3’。

（缓冲体系：10X反应缓冲液2．5μl，MgCL2(25mmol／L)1．5μl，dNTP(10mmoL／L)1．0μl，上游引物(10~μmoL／L)0．5μl，下游引物(10μmol／L)0．5μl，Taq酶(5U／μL)0．3μl，

模板2．0μl，总体积25μl。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，55％退火1min，72oC延伸1min，共40个循环，72℃延伸7min，至4℃结束。

以双蒸水代替DNA模板作为阴性对照。）IκBα基因扩增对HRS细胞、背景中反应性增生细胞的IκBα6个外显子进行半巢式PCR扩增。用已知IκBα外显子PCR扩增阳性的标本为模板作阳性对照，用双蒸水作为阴性对照。PCR扩增反应体系扩增IκBα第一和第二外显子反应体系：10XPCR缓冲液5．0μ1，MgC1：(25mmoi／L)5．0μIxl，dNTPs(10mmol／μL)2．0μl，DMSO2．0μl，TaqDNA聚合酶(5U／pJ)1．0μl，DNA模板(0．5g／IL1)2．0μl，扩增第一外显子时加引物1μIxl；扩增第二外显子时加引物0．3μl，补所需ddH2O使反应体系达到50μI。反应条件：预变性95℃，5min，继而95℃变性50s，65℃退火30s，72℃延伸90S，共35个循环，最后72℃延伸10min。第二轮，反应体系50μl，扩增第一和第二外显子时加引物1．25μl。扩增第一外显子时另加2μlDMSO(扩增第二外显子时不加DMSO)。反应条件同第一轮。扩增IκBα第三到第六外显子反应体系：

第一轮，l0×PCR缓冲液5．0μIxl，MgCL2(25mmol／L)4．0l，dNTPs(10mmol／L)2．0l，TaqDNA聚合酶(5U／μL)1．0μl，DNA模板(0．5μg／

μL)2．0μl，引物1μl。反应条件同扩增一、二外显子者，但退火温度为63℃。第二轮，反应体系同第一轮，但扩增引物为1．25μL。反应条件为预变性95℃，5min，继而95℃变性50S，65℃退火30S，72oC延伸90S，共35个循环，最后72℃延伸10min。）PCR产物检测取5μlPCR产物，用2％琼脂糖凝胶电泳分析，稳流120mA，20min。紫外灯下观察。IκBα的6个外显子阳性扩增产物大小分别为exon1(476bp)、exon2(433bp)、exon3(399bp)、exon4(184bp)、exon5(381bp)和exon6(441bp)。预期结果——电泳电泳条带不在同一水平线上——基因明显突变。预期结果——电泳电泳条带在同一水平线上。没有突变点突变或分子量很小的碱基序列突变待测基因外含子测序每管DNA样品都要扩增2次，使用上海博亚公司ABI377DNA测序仪对PCR阳性产物进行直接测序。扩增第一外显子时另加2μlDMSO(扩增第二外显子时不加DMSO)。第二轮，反应体系同第一轮，但扩增引物为1．25μL。IκBα基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化其特点为：①临床上病变往往从一个或一组淋巴结开始，逐渐由邻近的淋巴结向远处扩散。OverexpressionofIkappaBalphawithoutinhibitionofNF-kappaBactivityandmutationsintheIkappaBalphageneinReed-Sternbergcells[J].巢式聚合酶链反应(nestedpolymearsechainreaction,nPCR)也称套式PCR。6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除内源性过氧化物酶；LeicaASLMD激光显微系统电泳条带在同一水平线上。第二轮，反应体系同第一轮，但扩增引物为1．25μL。点突变或分子量很小的碱基序列突变[2]DejardinE,etal.EnVision两步法Thankyou！扩增第一外显子时另加2μlDMSO(扩增第二外显子时不加DMSO)。每管DNA样品都要扩增2次，使用上海博亚公司ABI377DNA测序仪对PCR阳性产物进行直接测序。Blood,1999,94(9):3129-34.C、D分别为没有突变的正、反向测序Emmerich等人的研究表明HRS细胞中IκBαmRNA高表达，但在蛋白水平检测的阳性强度弱，可能与HL中泛素化降解活性增强有关，也可能由IκBα蛋白结构改变导致。电泳条带不在同一水平线上——基因明显突变。一个是正向引物（上游引物），用它来测序就是正向测序(从上游往下测序)，也就是5'到3'预期结果——测序碱基序列出现改变图A-箭头处为T-A突变（TGA为终止密码）图B-反向测序证实（蓝色-C,红色-T，绿色-A，黑色-G）预期结果碱基序列没有突变C、D分别为没有突变的正、反向测序预期结果肿瘤细胞IκBα基因突变率高，而反应性增生的淋巴细胞IκBα基因没有突变。肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的IκBα基因都没有突变。肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的IκBα的突变率都增加IκBα基因参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化有关IκBα基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化估计不会发生这种情况，如若发生则需要进一步研究参考文献[1]BargouR.C,etal.Constitutivenuclearfactor-kappaB-RelAactivationisrequiredforproliferationandsurvivalofHodgkin’sdiseasetumorcells[J].JClinInvest,1997,100(12):2961-9.[2]DejardinE,etal.RegulationofNF-kappaBactivitybyIkappaB-relatedproteinsinadenocarcinomacells[J].Oncogene,1999,18(16):2567-77.[3]EmmerichF,etal.OverexpressionofIkappaBalphawithoutinhibitionofNF-kappaBactivityandmutationsintheIkappaBalphageneinReed-Sternbergcells[J].Blood,1999,94(9):3129-34.……Thankyou！巢式PCR巢式聚合酶链反应(nestedpolymearsechainreaction,nPCR)也称套式PCR。在这种技术中，首先用一对外引物进行第1轮PCR，然后再使用第1对引物扩增的DNA序列内部的一对引物再次扩增，所以称为巢式PCR。为了经济节约，可在第2轮扩增时采用半巢式，设计单条引物，另一条引物与第1轮扩增共用，。反向测序一个是正向引物（上游引物），用它来测序就是正向测序(从上游往下测序)，也就是5'到3'另外一个就是反向引物（下游引物），用它来测序就是反向测序（从下游往上测序），也就是3'到5'如果片段在800以内，那么随便进行一个方向就能测出你全部的序列了如果在800-1600之间，那么就要同时进行正反向测序才能测出你的片段（因为一个方向上的测序结果最好也只能保证800bp以内是可信的）10XPCR缓冲液5．0μ1，MgC1：(25mmoi／L)5．0μIxl，dNTPs(10mmol／μL)2．0μl，DMSO2．0μl，TaqDNA聚合酶(5U／pJ)1．0μl，DNA模板(0．5g／IL1)2．0μl，扩增第一外显子时加引物1μIxl；扩增第二外显子时加引物0．3μl，补所需ddH2O使反应体系达到50μI。（缓冲体系：10X反应缓冲液2．5μl，MgCL2(25mmol／L)1．5μl，dNTP(10mmoL／L)1．0μl，上游引物(10~μmoL／L)0．5μl，下游引物(10μmol／L)0．5μl，Taq酶(5U／μL)0．3μl，Constitutivenuclearfactor-kappaB-RelAactivationisrequiredforproliferationandsurvivalofHodgkin’sdiseasetumorcells[J].用已知IκBα外显子PCR扩增阳性的标本为模板作阳性对照，用双蒸水作为阴性对照。IκBα作为重要的NF-κB通路抑制因子，在多种瘤细胞中表达量均减少。为了经济节约，可在第2轮扩增时采用半巢式，设计单条引物，另一条引物与第1轮扩增共用，。电泳条带在同一水平线上。6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除内源性过氧化物酶；Blood,1999,94(9):3129-34.霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’slymphoma，HL，Hodgkin’sdisease，）是恶性淋巴瘤的一个独特类型。模板2．0μl，总体积25μl。有研究发现NF-κB(RelA/P50)的组成性激活是霍奇金淋巴瘤细胞的特点。这种特殊的瘤巨细胞来源于B淋巴细胞(镜影细胞)扩增IκBα第三到第六外显子反应体系：（缓冲体系：10X反应缓冲液2．5μl，MgCL2(25mmol／L)1．5μl，dNTP(10mmoL／L)1．0μl，上游引物(10~μmoL／L)0．5μl，下游引物(10μmol／L)0．5μl，Taq酶(5U／μL)0．3μl，C、D分别为没有突变的正、反向测序但证据均不足，HL的发病机制Blood,1999,94(9):3129-34.[3]EmmerichF,etal.

EnVision两步法DAKOEnVision显色系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即

EnVision）直接放大信号40-50倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。特点：敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生物素干扰）。

CD30免疫组化采用EnVision两步法。将冰冻组织切成6μm厚连续切片，贴于LeicaPEN膜空白切片上，用含0．05％NP40的丙酮(v／v)固定10min，室温下自然干燥；CD30免疫组化6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除内源性过氧化物酶；加1：20稀释的一抗；加相应的二抗，DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，充分水洗。预期结果——电泳电泳条带在同一水平线上。没有突变点突变或分子量很小的碱基序列突变参考文献[1]BargouR.C,etal.Constitutivenuclearfactor-kappaB-RelAactivationisrequiredforproliferationandsurvivalofHodgkin’sdiseasetumorcells[J].JClinInvest,1997,100(12):2961-9.[2]DejardinE,etal.RegulationofNF-kappaBactivitybyIkappaB-relatedproteinsinadenocarcinomacells[J].Oncogene,1999,18(16):2567-77.[3]EmmerichF,etal.OverexpressionofIkappaBalphawithoutinhibitionofNF-kappaBactivityandmutationsintheIkappaBalphageneinReed-Sternbergcells[J].Blood,1999,94(9):3129-34.……Thankyou！Constitutivenuclearfactor-kappaB-RelAactivationisrequiredforproliferationandsurvivalofHodgkin’sdiseasetumorcells[J].CD30单抗（Dako公司，克隆号Ber—H2，效价1：20）PCR引物（北京赛百胜公司）6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除内源性过氧化物酶；如果在800-1600之间，那么就要同时进行正反向测序才能测出你的片段（因为一个方向上的测序结果最好也只能保证800bp以内是可信的）电泳条带在同一水平线上。加相应的二抗，DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，充分水洗。第二轮，反应体系同第一轮，但扩增引物为1．25μL。6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除内源性过氧化物酶；IκBα作为重要的NF-κB通路抑制因子，在多种瘤细胞中表达量均减少。电泳条带在同一水平线上。为了经济节约，可在第2轮扩增时采用半巢式，设计单条引物，另一条引物与第1轮扩增共用，。DAKOEnVision显色系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即

EnVision）直接放大信号40-50倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。肿瘤细胞IκBα基因突变率高，而反应性增生的淋巴细胞IκBα基因没有突变。其特点为：①临床上病变往往从一个或一组淋巴结开始，逐渐由邻近的淋巴结向远处扩散。[1]BargouR.以双蒸水代替DNA模板作为阴性对照。扩增IκBα第三到第六外显子反应体系：第一轮，l0×PCR缓冲液5．0μIxl，MgCL2(25mmol／L)4．0l，dNTPs(10mmol／L)2．0l，TaqDNA聚合酶(5U／μL)1．0μl，DNA模板(0．5μg／μL)2．0μl，引物1μl。Thankyou！为了经济节约，可在第2轮扩增时采用半巢式，设计单条引物，另一条引物与第1轮扩增共用，。点突变或分子量很小的碱基序列突变IκBα的6个外显子阳性扩增产物大小分别为exon1(476bp)、exon2(433bp)、exon3(399bp)、exon4(184bp)、exon5(381bp)和exon6(441bp)。[3]EmmerichF,etal.C、D分别为没有突变的正、反向测序扩增目的基因，上游引物：5’-CACACTGTGCCCATCTACG-3’，下游引物：5’一GGTc1-ITI’GCGGATGTCCAC一3’。但证据均不足，HL的发病机制加相应的二抗，DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，充分水洗。霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’slymphoma，HL，Hodgkin’sdisease，）是恶性淋巴瘤的一个独特类型。6％H2O2-甲醇，37℃10min，消除内源性过氧化物酶；①了解IκBα基因在HL中突变的情况；RegulationofNF-kappaBactivitybyIkappaB-relatedproteinsinadenocarcinomacells[J].为了经济节约，可在第2轮扩增时采用半巢式，设计单条引物，另一条引物与第1轮扩增共用，。扩增第一外显子时另加2μlDMSO(扩增第二外显子时不加DMSO)。DAKOEnVision显色系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即

EnVision）直接放大信号40-50倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。肿瘤细胞IκBα基因突变率高，而反应性增生的淋巴细胞IκBα基因没有突变。Constitutivenuclearfactor-kappaB-RelAactivationisrequiredforproliferationandsurvivalofHodgkin’sdiseasetumorcells[J].IκBα基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化第二轮，反应体系50μl，扩增第一和第二外显子时加引物1．25μl。为了经济节约，可在第2轮扩增时采用半巢式，设计单条引物，另一条引物与第