2、细菌分离培养、接种技术及生化

第三章临床细菌学检验技术

第二节细菌分离培养与鉴定P35

细菌在适宜的条件下方可生长繁殖，临床细菌标本只有经过细菌的分离培养鉴定和药敏试验，才能对感染性疾病作出病原学诊断和指导临床用药。故细菌的分离培养对疾病的预防与诊治有重要作用。2021/5/91一、培养基的种类和选择

(一)基本条件1.合格的细菌实验室2.合格的无菌实验室3.基本设备和器具2021/5/92(二)培养基培养基(culturemedium)是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。用途：①可用于细菌的分离纯化、传代和菌种保存②可用于研究细菌的生理生化特性③是对病原菌分离鉴定的主要环节和必不可少的手段2021/5/931.培养基的组成成分：⑴营养物质：水、蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖醇类、血液、无机盐、鸡蛋和动物血清、生长因子（Vit、aa、嘌呤、嘧啶等）。2021/5/94⑵凝固物质：最常用的为琼脂(agar)，它是从石花菜中提出来的一种半乳糖胶，100℃溶解，40℃凝固，可利用琼脂来改变培养基的物理性状(固体或半固体)，它是理想的固体培养基的赋形剂，其本身不被细菌分解利用，也无营养作用。2021/5/95⑶抑菌剂和指示剂：不是细菌生长繁殖的必需物质，是制备细菌的选择、鉴别培养基和判断结果的需要。

常用的抑菌剂有：胆盐、煌绿、亚硫酸钠、亚硒酸钠及一些染料和某些抗生素等。

常用的指示剂有：酚红、中性红、甲基红、溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝、中国兰等酸碱指示剂，美兰为常用的氧化还原指示剂。2021/5/962.培养基的分类液体培养基：牛肉汤(牛肉浸液+1%蛋白胨+0.5%NaClpH7.4)半固体培养基：加0.2~0.5%agar固体培养基：营养物+2%agar

按物理性状2021/5/97基础培养基：是其他培养基的基础，如普通肉汤、普通琼脂平板、斜面、高层营养培养基：BAP、罗-琴培养基、吕氏血清斜面选择培养基：SS平板、BS平板、Mac平板等鉴别培养基：糖发酵管、MIU、KIA、TSI等特殊培养基：厌氧培养基、高渗培养基等按用途2021/5/983.常用培养基的制备⑴肉膏汤的制备：

0.3%牛肉浸膏+1%蛋白胨+0.5%NaCl加热溶解，调pH7.4~7.6，分装，121℃，20分钟高压灭菌冷后待用。可用于标本和细菌的增菌。⑵普通琼脂平板、斜面、高层：

肉膏汤+2%agar，加热溶解，121℃，20分钟高压灭菌冷至50℃平皿→普通琼脂平板：分离纯培养和药敏倾倒试管(斜放)→普通琼脂斜面：增菌、保存细菌试管(直立)→普通琼脂高层：备用

2021/5/99⑶血琼脂平板：普通琼脂平板营养物质灭菌冷至50℃+5%~10%脱纤维SRbc或RRbc，摇匀，倾倒无菌平皿，冷凝后即成血平板。常用于营养要求较高的细菌的分离纯培养和药敏。⑷半固体肉汤：牛肉汤(牛肉浸膏汤)+0.2%~0.5%agar→加热溶化→分装→高压灭菌→冷却即成。常用于保存菌种和观察细菌的动力。2021/5/9104.选择适当的培养基：根据临床标本中细菌的需要，选择适当的培养基。2021/5/911二、分离培养（一）细菌的分离1.平板划线分离法——分离纯培养①分区划线②连续划线2.斜面接种法连续蜿蜒划线，从斜面底部至斜面顶端3.液体接种法在试管内壁与液面交接处管壁上研磨，使细菌混于液体中。4.半固体接种法穿刺接种法2021/5/912倾注平板法

取一定量的稀释标本加入无菌平皿，再加入冷至45℃左右的定量培养基，混匀，待凝后倒置培养。6.涂布法

把稀释定量被检菌液均匀涂布于琼脂平板表面。7.定量接种环法

把定量接种环沾取菌液均匀涂布于琼脂平板表面。2021/5/913(二)细菌的培养方法

根据临床初步诊断及待检细菌的种类，可选用不同环境条件进行培养，常用培养方法有：1.需氧培养：适用于需氧菌和兼性厌氧菌，在有氧环境下35℃孵育18~24h。2.CO2培养：适用5%~10%CO2环境才生长良好的细菌，如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、布鲁菌的首次分离培养。供给CO2的方法有：CO2培养箱、烛缸法、化学法(每升容积0.4gNaHCO3+0.35ml浓HCl)。3.厌氧培养法：适用于厌氧菌的分离培养，常用的方法有厌氧罐法、气袋法和厌氧手套箱法等。2021/5/9142021/5/915(三)细菌的生长情况在平板上——呈菌落(colony)生长，常用于细菌分离纯培养在斜面上——呈菌苔或菌落生长，可用于增菌或保存菌种。半固体中——呈迁徙生长(有动力)。可用于观察动力和保种。在液体中——呈表面生长，均匀混浊生长和沉淀生长。可用于增菌和鉴别细菌。2021/5/916思考题细菌有哪些分离培养与接种技术？简述细菌在不同培养基中的生长情况及实际意义？2021/5/917三、生化反应

由于不同种类细菌的酶系统不同，故其新陈代谢过程中的合成代谢产物（毒素）与分解代谢产物（生化反应）也不一样，借此可鉴别细菌。生化反应：不同菌体内具有不同的独特酶系统，故对各底物(糖、蛋白等)的分解产物也不一样，用此方法来鉴别细菌叫生化反应。2021/5/918（一）碳水化合物的代谢试验1.糖(醇、苷)类发酵试验

产酸(+)：丙酮酸、乳酸、甲酸等原理：细菌糖类产酸产气⊕：CO2、H2不分解：(-)

由于不同细菌菌体内的酶系统不同，可分解单糖（葡萄糖）,双糖（乳糖），多糖（淀粉）和醇类（甘露醇），糖苷（水杨苷），代谢产物也不一样，可借此来鉴别细菌。酶2021/5/919培养基：肉膏汤+1%待试糖+指示剂→溶化调pH7.4±→分装→高压灭菌冷后待用。有液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。方法：把分纯的细菌→1%糖(醇、苷)类培养基，35℃18~24h→观察结果。产酸产气：如大肠埃希菌→GS→结果+产酸不产气：如伤寒b、痢疾b→GS→+-培养基不变色：如卡他莫拉菌应用：是鉴别细菌最主要和最基本的试验，特别是肠杆菌科鉴定的主要试验。⊕⊕2021/5/9202.氧化-发酵试验(O/F试验)原理：

分解GS—氧化型细菌，如微球菌、绿脓b

细菌

分解GS—发酵型细菌，如葡萄c、肠杆菌科不分解GS—产碱型细菌，如莫拉莫拉菌培养基：HL培养基(蛋白胨2g、NaCl5g、GS10g、agar2.5g、K2HPO4·12H2O0.3g、0.2%溴麝香草酚兰12ml、加蒸馏水至1000ml，调pH7.2）碱性时为绿色，酸性时为黄色。方法：将待测菌同时穿刺接种两支HL培养基，其中一支滴加无菌液体石蜡(高度不少于1cm)，35℃培养48h。有O2有O2或无O22021/5/921结果：应用：检测细菌的代谢类型，进而鉴别细菌。如肠杆菌科细菌为发酵型，而非发酵菌为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌(发酵型)和微球菌(氧化型)的区别。注意事项：①对营养要求高的细菌应在HL培养基中加入2%血清或0.1%的酵母浸膏。②阴性者要延长培养时间3~4天再观察结果。③指示剂不能用酒精溶解。液体石蜡2021/5/9223.β-半乳糖苷酶(ONPG)试验原理：ONPG邻-硝基酚+β-D-半乳糖试剂：0.75MONPG溶液，为无色，若出现黄色，则不应再用。方法：从KIA斜面上刮取菌苔，加入0.25ml无菌NS制成菌悬液，加入1滴甲苯充分振摇，使β-半乳糖苷酶释放，置37℃水浴5分钟，加入0.25mlONPG试剂，水浴(35~37℃)20min~3h，观察结果。结果：菌悬液呈现黄色为阳性。β-半乳糖苷酶水解2021/5/923应用：

本试验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。

迟缓分解乳糖的细菌(宋内志贺菌等)只有β-半乳糖苷酶(胞内酶)，缺乏半乳糖苷渗透酶(胞外酶)或活性很低，故需几天才能将乳糖分解，若采用ONPG试验则可迅速(20~30min)得出结果。因为ONPG与乳糖十分相似，且分子较小，它不需半乳糖苷渗透酶则可进入细胞内，而被细胞内的β-半乳糖苷酶分解为半乳糖和黄色的邻-硝基酚。

ONPG试验结果不一定与分解乳糖相一致，这主要取决于细菌产生的酶及其活性。若无ONPG，可采用5%的乳糖代替，同时减少蛋白胨的含量。2021/5/9244.七叶苷水解试验原理：七叶苷(esculin)+H2O七叶素+GS

七叶素+Fe2+(培养基中)黑色化合物培养基：

七叶苷培养基、胆汁七叶苷培养基。方法：

把待测菌接种于七叶苷培养基，35~37℃，18~24h。结果：

培养基变黑为阳性，不变色为阴性。应用：

主要用于肠球菌(+)与其它链球菌(-)的鉴别。也可用于革兰阴性杆菌(-)和厌氧菌(+)的鉴别。细菌2021/5/9255.甲基红试验(methylredtest)原理：GS丙酮酸→乳酸、甲酸、乙酸，pH↓本试验以甲基红为指示剂，因此：当pH﹥5.4时呈黄色，为阴性当pH﹤4.5时呈红色，为阳性当pH在4.5~5.4时呈桔红色，为弱阳性培养基：葡萄糖蛋白胨水方法：将待测菌接种于上述培养基中，35℃2~4天，加入甲基红指示剂，立即观察结果。应用：用于鉴别大肠埃希菌(+)和产气肠杆菌(-)，其他肠杆菌科中沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属均为阳性，而肠杆菌属和哈夫尼亚属均为阴性。产气杆菌2021/5/9266.V-P试验(Voges-Proskauertest)原理：细菌→GS→丙酮酸乙酰甲基甲醇+CO2

乙酰甲基甲醇丁二酮(二乙酰)

丁二酮+胍基(培养基中精氨酸中含有胍基)→红色化合物培养基：葡萄糖蛋白胨水方法：将待测菌接种于上述培养基中，35℃48h后，加入甲液(6%α-萘酚酒精溶液)和乙液(40%KOH)，振摇。结果：在数分钟内出现红色者为阳性，若无红色出现且置于35℃4h后仍如故者为阴性。应用：本试验与甲基红试验往往同时使用，一般前者为阳性，后者为阴性。脱羧-2HKOH2021/5/927(二)

蛋白质和氨基酸的代谢试验1.明胶液化试验：原理：某些细菌半固体明胶氨基酸变成流动的液体。方法：待测菌穿刺接种于明胶培养基，22℃7天，观察结果。35℃中明胶自动液化，若在35℃培养，观察前先置于4℃中30分钟后，再看结果。结果：培养基呈液化状态为阳性。应用：肠杆菌科细菌的鉴别。Eg：沙雷菌，普通变形杆菌，奇异变形杆菌，阴沟杆菌；某些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌；多数假单胞菌也能液化明胶。明胶酶(胞外酶)分解2021/5/9282.吲哚试验(IndoleTest)原理：

色氨酸吲哚+丙酮酸

吲哚+吲哚试剂(对二甲氨基苯甲醛)→玫瑰吲哚培养基：蛋白胨水方法：将待测菌接种于上述培养基中，

35℃24~48h，加入吲哚试剂，观察结果结果：于两者液面交界处出现红色为阳性，不变色为阴性。应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴别，如大肠埃希菌为(+)，产气肠杆菌(-)。色氨酸酶某些细菌2021/5/9293.硫化氢试验原理：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸产生H2S，当它与培养基中的Fe2+或铅离子相遇时，则形成黑褐色的FeS或PbS沉淀。此试验可间接用于检测是否产生H2S。培养基：醋酸铁(铅)培养基。方法：将待测菌接种于醋酸铁(铅)培养基中，

35℃培养1~2天，观察结果。结果：培养基变黑为阳性，不变色为阴性。应用：主要用于肠杆菌科中细菌属和种的鉴别。沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属，绝大多数为阳性，其他菌属为阴性。2021/5/9304.尿素分解试验原理：某些细菌具有尿素酶，使尿素分解产生大量氨，使培养基呈碱性(酚红为指示剂)，培养基变红。培养基：尿素培养基方法：

将待测菌接种于上述培养基中，35℃培养18~24h，观察结果。结果：培养基变红为阳性，不变色为阴性。应用：主要用于变形杆菌属的鉴定，另外雷氏普罗威登菌和莫根菌也为阳性。2021/5/9315.苯丙氨酸脱氨酶试验原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，加入FeCl3试剂后呈绿色反应。培养基：苯丙氨酸琼脂培养基方法：将待测菌接种于上述斜面培养基中，35℃培养18~24h，滴加3滴FeCl3试剂，自上流下，立即观察结果。若延长时间观察会引起褪色。结果：出现绿色为阳性。应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。变形杆菌、摩根摩根菌为阳性。2021/5/9326.氨基酸脱羧酶试验原理：氨基酸胺+CO2，胺使培养基变碱，指示剂则变色。培养基：氨基酸脱羧酶和氨基酸对照培养基。方法：将待测菌接种于上述培养基中，35℃1~4天，观察结果。结果：对照管呈黄色，测定管呈紫色(溴甲酚紫为指示剂)为阳性，若测定管也为黄色则为阴性。若对照管呈紫色则试验毫无价值。应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，均阳性。志贺菌中除宋内和鲍氏外，均阴性特异脱羧酶2021/5/933赖氨酸→尸胺鸟氨酸→腐胺精氨酸→精胺2021/5/934(三)碳源和氮源利用试验1.枸橼酸盐利用试验(citratetest)原理：某些细菌能分解枸橼酸盐(获得碳源)，使培养基变碱(原pH6.8→pH↑)，培养基(溴麝香草酚兰为指示剂)由淡绿变为深蓝色。培养基：枸橼酸盐斜面培养基方法：将待测菌接种于上述培养基中，35℃1~4天，观察结果。结果：由淡绿变为深蓝色为阳性，不变色为阴性。应用：用于肠杆菌科中菌与属的鉴定。如沙门菌属、克雷伯菌属一般为阳性，其他菌属一般为阴性。2021/5/9352.丙二酸盐利用试验原理：某些细菌能将丙二酸盐分解成碳酸钠，使培养基变碱(原pH6.8→pH↑)，培养基(溴麝香草酚兰为指示剂)由淡绿变为深蓝色。培养基：丙二酸盐培养基方法：将待测菌接种于上述培养基中，35℃1~2天，观察结果。结果：培养基由淡绿变为深蓝色为阳性(指示剂同上)，不变色为阴性。应用：用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。克雷伯菌属，亚利桑那菌为阳性。2021/5/936IMViC试验*：是鉴别细菌常用的一组生化试验。

IMVC如：大肠埃希菌++--

产气肠杆菌--++2021/5/937（四）各种酶类试验1.氧化酶试验(kovactest)原理：还原型细胞色素C氧化型细胞色素C四甲基对苯二胺有色的醌类化合物方法：①滤纸法：取洁净滤纸一小块，沾菌少许，滴加试剂。②试剂纸片法：将滤纸片浸泡于试剂中制成试剂纸片，取菌涂于试剂纸片上。 ③菌落法：直接滴加试剂于被检菌落上。结果：10秒钟内呈深紫色为阳性。同时应以铜绿假单胞菌(+)与大肠埃希菌(-)做对照。应用：主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别（发酵菌与非发酵菌鉴别），另外奈瑟菌属和莫拉菌属也呈阳性反应。细菌氧化酶氧化型细胞色素C2021/5/9382.触酶试验(H2O2酶试验)原理：具有触酶的细菌，能催化H2O2生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。即：

H2O2H20+O2↑(出现气泡)试剂：3%过氧化氢溶液方法：玻片法和试管法结果：产生气泡为阳性，不产生气泡为阴性应用：常用于G+C的初步鉴定，如葡萄球菌(+)，而链球菌为(-)。触酶2021/5/9393.硝酸盐还原试验(nitratereductivetest)原理：硝酸盐亚硝酸盐+氨亚硝酸盐+试剂→颜色反应(红色)培养基：硝酸盐培养基试剂：甲液(对氨基苯磺酸溶液)；乙液(α萘胺醋酸溶液)方法：将待测菌接种于硝酸盐培养基中，35℃1~4天，加入0.1ml甲、乙等量混合液，摇匀，立即观察结果。结果：呈红色为阳性，若加入试剂后无颜色反应可能为：①硝酸盐没有被还原，试验为阴性。②若再加入少许锌粉，呈红色者则表明试验确为阴性，若仍不产生红色者为假阴性(锌＋亚硝酸＝红色芳基肼)应用：如肠杆菌科细菌均为阳性;铜