工具酶的发现和基因工程的诞生

上选修课的要求：1.自己上课过程中产生的垃圾必须要带走2.上课过程中会随机点名，无故缺勤者一次扣10分。3.有作业时，晚上以班级为单位上交，文科同学复印下选修3内容的部分4.值日生安排选修3目录中不要求内容：第一章第四节去除第二章第一节去除第四章整章去除第五章第三节、第四节去除关于“现代生物科技”的学习——引言生物科技经历微观和宏观两方面的发展遗传工程与基因工程的关系“遗传工程”泛指把一种生物的遗传物质（细胞核、染色体脱氧核糖核酸等）移到另一种生物的细胞中去，并使这种遗传物质所带的遗传信息在受体细胞中表达。苏云金杆菌毒蛋白普通棉花抗虫棉变异类型：操作水平：意义：基因重组DNA分子水平1）基础理论研究方面：在基因的结构、功能和表达调控等方面有重要意义2.）生产实践方面：a.定向地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的品种。b.实现种间遗传物质的交换（克服远缘杂交的不亲和障碍、或克服生殖隔离）

“基因工程”的核心：构建重组DNA分子基因工程形成的是新品种。苏云金杆菌毒蛋白普通棉花抗虫棉苏云金杆菌可以合成毒蛋白想一想：要让棉花细胞合成毒蛋白，要把苏云金杆菌内的什么物质转移到棉花细胞？为什么？棉花细胞受体细胞把苏云金杆菌的毒蛋白基因转移到棉花细胞，让棉花合成毒蛋白。为什么毒蛋白基因在棉花细胞中表达后合成的仍然是毒蛋白？共用一套密码子1.“DNA是遗传物质”的发现2.DNA双螺旋结构的确立及遗传信息传递方式的认定基因工程的理论基础毒蛋白基因（DNA）目的基因我们面对的问题？苏云金杆菌毒蛋白抗虫棉1.DNA分子太长（所含基因多，如人的一个DNA分子中含有上千个基因），不易操作2.DNA分子易被水解基因剪刀:限制性核酸内切酶运输工具：载体基因的针线：DNA连接酶工具酶仅指限制性核酸内切酶和DNA连接酶，不包含载体。注意：基因工程中的工具与工具酶的区别解决培育抗虫棉的关键步骤需要的工具：基因的剪刀：基因的针线：基因的运输工具：载体，将外源基因运送到细胞（受体细胞）中，并保证目的基因表达和复制。DNA连接酶限制性核酸内切酶基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。DNA分子的直径只有2.0nm（粗细只有头发丝的十万分之一），要在如此细小的DNA分子上进行剪切和拼接，是一项非常精细的工作，必须要有专门的工具。一、基因的剪刀——限制性核酸内切酶2、功能

特点：能够识别和切割DNA分子内一小段特殊（脱氧）核苷酸序列的酶。3、结果：专一性，即一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的位点将DNA分子切断。（注意切割外来的DNA而不切割自身的DNA）产生粘性末端1、来源：在细菌等微生物内。种类很多。切割的本质：在特定位点水解磷酸二酯键EcoRⅠ切割DNA的实例A磷酸二酯键1‘2’3‘4’5‘1‘2’3’4‘5’GAATTGCCTTAAG3’3’5’5’AATTGCCTTAAGEcoRⅠ氢键可以自发断裂和形成请分别说出上述两种限制性核酸内切酶的识别序列和切割位点？回文序列

书写重播5’3’5’3’大肠杆菌中EcoRI限制性核酸内切酶的作用过程限制性核酸内切酶切一次形成几个粘性末端？产生的2个粘性末端具有什么关系？

什么叫粘性末端？当限制性核酸内切酶从识别序列的特定位点切割后，被限制性核酸内切酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫粘性末端。

当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。有信息时才需要考虑思考题：要想获得目的基因，其必须含有几个相应限制性核酸内切酶的识别位点？可产生几个粘性末端？目的基因左右各一个识别位点，，产生4个粘性末端。目的基因限制性核酸内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后形成的粘性末端。DNA连接酶用EcoRⅠ切割后的某一环状DNA分子用EcoRⅠ切割后的目的基因二、基因的针线——DNA连接酶1、作用:将具有末端碱基互补的2个DNA片段连接起来，形成重组DNA分子。2、连接的部位:是DNA骨架上的缺口（也就是建立磷酸二酯键，若缺乏碱基，DNA连接酶无法发挥作用）3、意义：可以将限制性核酸内切酶切割下来的基因（DNA片段）与另外被切割开的DNA分子连接到一起，为“基因重组提供了可能”。限制性核酸内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性核酸内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。在DNA连接酶的作用下，两种不同限制酶切割后形成的粘性末端能否连接起来？为什么？可以连接。因为由两种不同限制酶切割后形成的粘性末端是互补的G

AA

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GEcolⅠ切割DNA连接酶在脱氧核糖与磷酸基团之间形成

磷酸二酯键氢键自发形成DNA连接酶分为两类：①从大肠杆菌中分离得到：EcoRⅠDNA连接酶，只能将双链DNA片段互补的粘性末端之间连接。②从T4噬菌体中分离到：

T4连接酶，既可以“缝合”双链DNA片段互补的粘性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。注意不同点：DNA连接酶是将DNA片段的末端连接起来，形成重组DNA。DNA聚合酶是在复制过程中将一个个游离的脱氧核苷酸连接形成子链上。DNA聚合酶和DNA连接酶有何相同和不同点？相同点：化学本质都是蛋白质，都催化形成磷酸二酯键。三、基因的运输工具——载体1.作用：能将外源基因送入受体细胞。为什么不能将目的基因直接导入受体细胞完成转化呢？2、作为载体的必要条件（特点）：①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存②具有多个限制性核酸内切酶酶切位点等3、载体种类P4：质粒和病毒（噬菌体、动物病毒、植物病毒）最常用的（运）载体－－质粒质粒――细菌拟核之外能自主复制的小型双链环状DNA分子，是特殊的遗传物质，并不是细胞器（酵母菌也有）；质粒的分布：细菌、真菌等。（注意最常用的质粒：大肠杆菌的质粒）质粒应具备以下几个条件：①在受体细胞内能自主复制和稳定的保存，②有多种限制性核酸内切酶切点；③具备易于检测与筛选的标记基因，如抗生素抗性基因（如四环素的抗性基因)、具有颜色反应的基因等；④对受体细胞无害。但天然质粒往往不能满足上述要求，因此需要根据不同目的和需要，对质粒进行人工改造，现在所使用的质粒几乎都是经过改造的。思考：质粒两条链中外侧链要长一点吗？

工具酶和质粒作为载体的发现为基因工程的诞生奠定了基础。

基因工程的研究历程：1)世界上首次成功的DNA体外重组实验，第一个人工DNA重组产物。2)细菌之间的性状转移，基因工程发展史上第一个成功的基因克隆实验，标志着基因工程的诞生。基本要求：1.说出基因工程的含义并指出基因工程的主要内容；2.说出限制性核酸内切酶的含义及作用特点；3.说出DNA连接酶的作用4.简述质粒的含义、特性及其在基因工程中的作用5.解释限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒对诞生基因工程的作用说明：对于限制性内切酶，只要求了解教科书中提到的两种限制性核酸内切酶的碱基识别序列和切割位点。思考1.为目的基因的分离和重组提供技术保障的是__________和________2.什么是限制性核酸内切酶？其化学本质是_____。能断裂________键，结果是形成_____________。1）不同的DNA用同一种限制性核酸内切酶切割粘性末端不相同。2）用不同限制性核酸内切酶切割粘性末端一定不同。××判断：1、基因工程操作的工具酶？工具？2、质粒的化学本质？最常用的载体是？3、判断：质粒是能复制的双链环状DNA分子.4、判断：大肠杆菌的质粒位于拟核中，是一种细胞器。5、判断：质粒不是遗传物质，质粒与染色体的化学本质相同。6、判断：DNA连接酶可将任意两个平末端的DNA片段连接。7、判断：限制性核酸内切酶的作用是识别并切割目的基因×√×

√×第一节上到这里为止分析限制性核酸内切酶的切割作用的一般方法1.将告知的识别序列补充为双链，明确识别序列及其碱基对数2.根据切点画出粘性末端3.对不同限制性内切酶的粘性末端进行比较作答1、下面是5种限制性核酸内切酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图（箭头表示剪切点、切出的断面为黏性末端）。限制酶1：—↓GATC—限制酶2：—CATG↓—限制酶3：—G↓GATCC—限制酶4：—CCGC↓GG—限制酶5：—↓CCATGG—下例叙述正确的是（）A．限制酶2和4识别的序列都包含4个碱基对B．限制酶3作用下形成的粘性末端包含5个碱基C．限制酶1和2切出的粘性末端相同D．限制酶1和3切出的粘性末端相同D注意：限制性核酸内切酶的切割位点不能推导，要看题目信息.2、某种限制性核酸内切酶的识别序列AAGCTT，切点在A和A之间。请画出为获得某DNA分子中某基因被该种限制性核酸内切酶切割后所形成的粘性末端。5’3’3’5’3’5’5’3’++×1）粘性末端书写的规范性；2）DNA片段之间尽量分开；3）必要的文字批注不同点：DNA连接酶是将不同DNA片段的末端连接起来，形成重组DNA分子。DNA聚合酶是在DNA复制过程中将一个个游离的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。DNA聚合酶和DNA连接酶有何相同和不同点？相同点：化学本质都是蛋白质，都催化形成磷酸二酯键。与核酸有关的几种酶的比较：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、解旋酶、DNA（水解）酶等。催化DNA转录为RNA：RNA聚合酶催化RNA合成DNA单链：逆转录酶

断裂氢键的酶：解旋酶水解DNA形成单个脱氧核苷酸的酶：DNA酶图中的高血压相关基因作为__________，质粒作为_________,二者需用________切割后连接成重组载体，该过程与质粒上含有________有关。重组DNA分子的筛选与质粒上含有____有关。同一种限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶切割位点

标记基因

限制性核酸内切酶作用后的电泳图请分别说出上述两种限制性核酸内切酶的识别序列和切割位点？练习：基本要求：1.说出基因工程的含义并指出基因工程的主要内容。2.说出限制性核酸内切酶的含义及作用特点。3.说出DNA连接酶的作用。4.简述质粒的含义、特性及其在基因工程中的作用。发展要求：解释限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒对诞生基因工程的作用说明：对于限