微生物饲料添加剂

微生物饲料添加剂乳酸菌的微生物学检验sljcw饲料检测网.中国饲料检测网一、概述乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。乳酸细菌主要包括23个属，通常在饲料中用作有益微生物的菌种有干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）、植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）、粪肠球菌(Enterococcusfaecium)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、屎肠球菌（Enterococcusfaecium）、乳酸乳杆菌(LactococcusLactis)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)等。乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。APT培养基通常用于分离绿色乳杆菌和其他乳杆菌及肉食杆菌。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基，还有利用磺胺二甲恶唑、制大肠菌素和结晶紫等作为选择因子。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。此外还有如溴甲酚紫培养基、CHALMERS培养基等也常用于乳酸菌的分离。以下举几个例子来说明乳酸菌的作用及特性。嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属（Lactobacillus）的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无鞭毛，接触酶阴性，和苦杏仁苷、纤维二糖、七叶灵、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、水杨苷、蔗糖反应为阴性，阿拉伯糖、葡糖酸盐、甘露醇、松三糖、鼠李糖、核糖、山梨糖、木糖反应为阴性。由于嗜酸乳杆菌在生长中可以产生一些抑菌物质，如有机酸、细菌素及类细菌素，可以抑制肠道中有害微生物生长繁殖，起到平衡肠道菌群的作用。并能产生B族维生素，包括各种叶酸、生物素、维生素B6和维生素K等，分泌各种有益物质，如乳酸、乙酸等，降低肠道pH值。粪肠球菌主要存在于人类或动物肠道，是人类和动物肠道的正常菌群等。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形，能在胆汁七叶苷琼脂上生长，不产生色素。乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状，接触酶阴性，不产细胞色素，在不加啤酒花的麦芽汁中生长，能利用半乳糖、阿拉伯糖、木糖和海藻糖产酸，不分解蛋白质，不产吲哚，不水解马尿酸盐。某些菌株能利用蔗糖和乳糖产微量的酸。不能利用麦芽糖、甘露醇、糊精等产酸，能产丁二酮。二、检测方法1范围本方法规定了微生物饲料中各乳酸菌(包括干酪乳杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳杆菌、戊糖片球菌)及其总数的测定及鉴定方法。本方法适用于微生物饲料中乳酸菌的检测。2术语：乳酸菌：一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，需氧和兼性厌氧，多数无动力，过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性的无芽胞杆菌和球菌。乳酸菌菌数总数：试料在一定条件下培养后，所得1mL试料中所含乳酸菌菌落的总数。俗3竿设仗备和非材料秤3商.1敬穗恒温布培养绿箱：始36炉±密1咽℃典。悔3捕.2瘦稍冰箱朗：0携~猎4模℃饿。育3申.3式睡恒温乎水浴亚：4露6排±极1谎℃仁3唐.4祝孩电炉说：可值调式典。喇3衬.5鱼臂吸管残：容特量为止1寄、贿10妇、肠25稻mL必。障3题.6腾杯广口冻瓶或密三角践瓶：地容量渔为5滋00姿定mL蓝。堂3徒.7址闯平皿凯：直另径为颤9征cm爬。辅3哗.8半宴试管昏：1烧8咽×吸18柱0译mm醒。匆3.嫩9室显微判镜。道3沙.1遍0肃高压锁灭菌崇锅。聋3.围11爬烘箱舱。所4透培养流基和侄试剂材4笔.1岭屿改良畜TJ桌A培质养基护（改挺良番乔茄汁旬琼脂红培养弄基）拿。攀4.礼2某改良找MC酿培养转基（鉴Mo构di供fi骑ed怠C侦ha煌lm春er慌s臭培养针基）泻。歇4侮.3肺0出.1贷%迎美兰趴牛乳序培养斯基。额4饱.4贡6嗽.5萍%葬氯化违钠肉茎汤。垫4甘.5小p第H9均.6济葡萄业糖肉覆汤。自4.陆6甩40判%胆滑汁肉曾汤。页4逮.7茅栗淀粉迁水解浑培养因基。缴4转.8什专精氨歉酸水茶解培狮养基敢。捎4侍.9坑鞋乳酸暴杆菌润糖发宗酵管继。言4扇.1羡0泪七叶迎苷培引养基揉。津4坚.1予1众革兰盐氏染炎色液市。忘4只.1蚕2束3%滑过氧座化氢锣溶液直。旺4毕.1脆3话蛋白年胨水威、靛售基质熟试剂菠。队4洪.1所4膝明胶散培养翠基。添4沃.1督5荒硝酸浊盐培肯养基杨、硝们酸盐附试剂斩。惧4麻.1范6吐生理烂盐水没：将舒蒸馏喘水加乒入饭8.判5花g折的食身盐中盼做成蒜10贸00牧接mL纱的溶败液。适在钟12铺1霜℃边下灭拔菌1搅5m田in此。析5夕乳酸悠菌菌驼落总甩数的坚测定踩5.来1释检验摆程序熔乳酸窄菌菌惕落总行数检傻验程虹序如薪下：试料试料作成几个适当倍数的稀释液作成几个适当倍数的稀释液选择2~3个适当稀释度，各以1选择2~3个适当稀释度，各以1mL之量加入灭菌平皿内每皿内加入适量改良TJA或改良MC培养基每皿内加入适量改良TJA或改良MC培养基72±172±1℃36±1℃菌落计数菌落计数报告报告束图：妥乳酸蛾菌检依测程挨序图序5.缴2鸦土操作旅步骤对5流.2敞.1滩以忆无菌太操作呜将经练过充茧分摇万匀的哗试料携25影蚕mL逐（或途25可衰g含）放喊入含驴有2岔25邀政mL值灭菌亲生理皇盐水烛的灭帐菌广批口瓶圾内作兽成谋1:眨10窜的均桥匀稀友释液橡。策5朱.2拆.2烘用1犁mL牵灭菌哑吸管净吸取舒1:绳10丝稀释作液源1哀mL卵，沿鞭管壁炒徐徐错注入拳含有移9谈mL勒灭菌侦生理兵盐水蛮的试伯管内携（注北意吸泛管尖泡端不浑要触仍及管曲内稀斜释液侮）。周5哭.2躲.3索另取斯1赚mL简灭菌腔吸管激，按窗上述案操作鱼顺序天，作注10纺倍递获增稀粒释液业，如婆此每浴递增顾一次饥，即拜换用妙1支折1活mL套灭菌执吸管布。税5昨.2仓.4崭选择鼠2~定3个胳以上婚适宜谁稀释丽度，员分别道在作纸10悔倍递兵增稀萄释的认同时价，即集以吸甲取该授稀释佳度的圆吸管附移1定棍mL接稀释州液于垄灭菌六平皿原内，致每个跳稀释抗度作旗两个齐平皿祖。碗5慌.2留.5霸稀释否液移宋入平住皿后攀，应岁即时你将冷蒸至任50啄℃烧的乳丘酸菌薯计数凯培养症基（街改良播TJ染A或姻改良那MC征）注挣入平奋皿约巩15谁孕mL踏，并猎转动近平皿针使混捷合均方匀。已同时盛将乳赴酸菌湖计数贡培养痛基倾绑入加臣有1私眼mL塑稀释肝液试怒料用索的灭念菌生昆理盐妻水的介灭菌静平皿言内作弊空白塌对照直，以挠上整可个操食作自们培养院物加冷入培疯养皿素开始尺至接篮种结级束须能在2国0偷mi擦n赖内完塘成。折5爷.2虚.6膝待琼王脂凝仁固后牢，翻寨转平探板，昌置3淘6挤±写1港℃法恒温吉培养锁箱内鸦培养炎72瓜±蹄1炎h管取出够，观业察乳迅酸菌庙菌落错特征专（见逝表1幻），幸选取草菌落锻数在驶30酿~3岔00放之间债的平落板进流行计轿数。套5屿.3佩络乳酸倡菌在砌改良撇TJ誉A和嗽改良斤MC韵培养斧基上劈菌落哲生长如形态派特征累见表植1。获表1丈傍乳晓酸菌怨菌落吗特征兽改良背TJ武A沈改良榜MC工杆菌据平皿太底为甘黄色伞，菌丘落中耗等大期小，垂微白孙色，墙湿润壮，边越缘不申整齐枣，直竟径3湾±画1飘mm懒，如某棉絮牙团状镇菌落汤。茄平皿督底为稳粉红些色，姑菌落恩较小式，圆还形，什红色也，边液缘似捆星状峰，直勾径2肚±押1社mm技，可佣有淡寄淡的朋晕。球球菌狂平皿延底为遮黄色幼，菌童落光亦滑，萍湿润撑，微惜白色便，边事缘整分齐。稿平板浸底为机粉红伟色，酱菌落艰较小寻，圆畏形，怀红色残，边将缘整反齐，粗可有偏淡淡检的晕旅。熔注：元干酪回乳杆杠菌在谷改良雹TJ贪A培农养基池上为弹圆形厅光滑奶，边负缘整国齐，逗侧面由呈菱傻形状野，挣6窗乳酸养菌的玉鉴定盖进行改革兰萄氏染鹊色，维显微诸镜检作查，着并做品过氧谜化氢容酶试拜验。籍革兰咏氏阳锣性，剑过氧庆化氢姑酶阴言性，朱无芽跟胞的毯球菌雹或杆恰菌可掌定为鼠乳酸控菌。种对上震述分睁离到躺的乳借酸菌涨需进院行菌使种鉴睛定，朗则作猎以下拐试验扭。晚6六.1炕节菌种匪制备疏：自端平板扫上挑天取菌杏落，扯接种块于改进良T题JA全或改姻良M及C琼燥脂斜休面，除于3解6撑±究1德℃犁，2设4~净48劳h伴培养语，刮握取菌模苔，理分别芳进行载下列包试验显。笔6遮.2酿象乳酸纸杆菌活鉴定妨试验雹：极做少见遵还原斯硝酸搭盐，骆不液身化明伸胶，康不产傅生靛让基质翅和硫保化氢防。连6歼.3骄几种阅乳杆般菌属眉内种启的碳轨水化帝合物宣反应雀，见标表2乡。粉6萌.4嫌肠球惩菌的那鉴别矮试验匪，见火表3营。仍6刘.5白扛肠球峡菌属刺与片秀球菌驴属容脂易混我淆，阻其鉴近别可持见表柏4。够表2址扣常见歉乳杆铜菌属膝内种致的碳启水化素合物催反应储七叶宴苷乒纤维劣二糖略麦芽具糖需甘露野醇祝水杨笨苷壶山梨使醇惹棉籽盟糖南蔗糖提干酪蒜乳杆等菌较+届+锤d控+劲+泻+炎-斤d撇嗜酸填乳杆欢菌恩+逐+焦+水-赤+舟-即d雄+旗植物歌乳杆才菌糠+喝+木+顺+光+躲+宝+爽+读注：矮d抓──饮有些位菌株嚷阳性侦，有锹些菌五株阴冬性；洗#姑──熟弱、别慢或色阴性界。刑表3东肠陆球菌刮的鉴歼别表率名称洗α朋-半贝乳糖值苷酶蹄L-且阿拉极伯糖麻甘露狡醇纷蜜二宿糖填山梨须醇霉丙酮辽酸发个酵室粪肠姨球菌烫-特-乔+无-鼓D+瑞+终屎肠悦球菌甲V宴V鹅V返V饼D-颂-洲注：把D+板，通唱常阳膨性；蜜D-扭，通滤常阴拢性；堵V，及不同饼或可吸变。舟表4丛肢链球锈属与阔片球垄菌属迫的鉴且别特蛮征皮链球待菌属盏片球良菌属判细胞纪形态农球或死卵圆幅形厦球形认排列钱成对吩，链悲四联达，成艰对窃接触摘酶栗-顷d决厌氧顾条件桂下生丘长良隆好洲+歇+纽从葡魔萄糖蛛产气辆-轻-亏抗万掉古霉励素率-笼+焦注：盏d哄──尾有些铜菌株占阳性快，有舰些菌介株阴铸性。坚7家结果其计算缺及表夹述趟7央.1暗饿乳酸司菌总汪数负菌落袋计数以后，达随机视挑取修5个管菌落叨进行庭鉴定尘。根很据证凉实为狡乳酸禽菌菌不落计订算出摩该皿唯内的燃乳酸木菌数勒，然段后乘觉其稀触释倍沟数即黑得每鱼毫升着样品毛中乳宵酸菌诸数。贪7.毕2