应用基因芯片检测禽常见病毒的

应用基因芯片检测禽常见病毒的研究*吴时友尹燕博郑彤彤韩丽敏田振宇张巧燕毛雪松山东澳兰生物工程研究院青岛市山东省266101摘要：利用RT-PCR或PCR技术扩增出新城疫病毒（Newcastlediseasevirus）、禽流感病毒（AvianInfluenza）、传染性支气管炎（Infectiousbronchitisvirus）、、鸡马立克氏病(Marek’sDisease)、传染性喉气管炎（Infectiouslaryngotracheitis）和鸡传染性法氏囊病(InfectiousbursalDisease)的各一段保守序列，通过微量点样技术这些探针点在硝酸纤维素膜上，从而产生二维DNA探针阵列，即基因芯片（genechip）。由病料中提取核酸，通过RT-PCR或PCR和标记技术，将获得的PCR产物和基因芯片进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品的快速，并行和高效的检测及分析。近年来，在养禽业的迅猛发展的同时，禽的病毒性疾病变得更加复杂，混合感染,交叉感染已成为目前疾病的显著特征。集约化养殖的发展要求快速，及时，准确的对疾病作出诊断，但目前的一些方法，如病毒分离、血凝（HA）、血凝抑制（HI）、琼脂扩散、ELISA等费时费力，且一次只可检测一种病原，不能够满足其要求。我们所研制的病毒病基因芯片(genechip)具有以上方法不可比拟的优越性。基因芯片(genechip)是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高薪技术，它主要是通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对DNA序列的准确、快速、大量信息的检测。芯片上集成的成千上万的密集排列的分子微阵列能在短时间内分析大量的生物分子，使人们快速准确地获得样品中的生物信息，其效率是传统的检测手段的成百上千倍，它是继大规模集成电路之后又一具有深远意义的科学技术革命。基因芯片技术应用于病毒性疾病可灵敏，特异，快速的检测病原，并且一次可检测多种病原,将有助于及时，快速，准确的发现病毒性疾病，避免病毒性病毒对养殖业造成的巨大损失，为养殖业的集约化发展创造有利的条件。1材料和方法1.1材料1.1.1试剂TaqDNA聚合酶购自上海生工，PCR产物纯化试剂盒购自v－gene生物科技，M-MLV、dNTP购自Promega公司，RNAsin购自大连宝生物工程,鲑鱼精DNA，购自Sigama公司，裂解液，由本研究院配制。1.1.2毒株NDV、AIV、IBV、MD、ILT、IBDV均购自中监所。声1.雄1.蜜3仪稀器和梢设备糟仪器搜和设稀备：宏PC管R仪棕；点弊样器蒜；杂煌交仪您；扫晋描仪绪均为振自行蜂设计当，委屑托生初产厂懂家制挑造。舅.2添.缝引物县设计说作者少:吴筋时友套(1鼠94闭1-宗),瓦男,代研究状员,虹主要荒从事扩生物趴技术婶在动办物疫组病诊肢断中歪的应葵用研瘦究。仁*专矮利号润：0仿21障55锦40倾8.摄0拒通过发ge胡ne店b俗an姜k展分别千查找换到N份DV群、A杂IV帮、I跳BV炉、M妥D、蚂IL莲T、仿IB电DV枕各数累条序斥列，涛然后闪使用配DN夜AS估ta溉r分胜析每挺一种浅病毒握的高县度保艇守序雪列，成设计适出针捷对这腥些病呢毒的号引物辆。引现物见祝表1橡。拌1.净3持基因找芯片旧的制阻作壳1.粮3.缓1种带毒核钥酸的剂提取巷各取奏细胞叉培养圣液4贺00生ul梦于1纲50衣0u徒l离喜心管阳中,指加裂透解液澡60两0u逆l,浓稍振严荡，延加入造氯仿拉45菌0u石l,尽振荡耗均匀轮后-枣20拜℃应静置舒10勇mi沈n。管12裹00箱0r葛/m系in略离心段10呆mi袭n,尘取上岸清于值新的鹅离心贷管中残，加伍异丙甜醇8畏00贷ul坐,傍-2格0斧℃郊静置遇1h忽。1佛20桐00演r/个mi拆nl藏离心股10山mi嫩n,申去上毕清，蕉沉淀下用冷中乙醇便洗涤膨，置异超净啄工作付台吹督干。根若病善毒基豪因组序是D俭NA蚊可直锅接进撕行P社CR雾，若广是R兰NA脱则要应进行添RT蹦。傅1.扭3.异2通核酸患探针炮的扩悟增霉以1劫.3真.1狠所获顺得的似核酸么为模苗板，禁使用疮1.胳2所醉设计歇的引秃物，为分别目扩增千出N伶DV兼、A次IV鸟、I收BV逼、M白D、咱IL规T、辩IB室DV渗的目创的片余断，兄以作丘为探牌针。谊PC冠R的透反应膏条件纠如下循氧反应坑体系罗：嫩水怕看染锻搞企爪匆界蝇挂壮存药界垂17肺ul粗蜓挽5铜×健bu挎ff牛er蝴章里骄脉额储筒炼宜纯梁胡4夸ul增Mg横cl占(2右5m迁M叫)详恨盗分根凉耀潜求念毙4论u惹l赚肉你dN典TP戏（各积2.摔5m禽M）际定压叫鸣极帖貌2巡.5青u唐l盟岂杏Ta伴q起(孤4U件)爱骑扁知锦鄙现睁鲁砖爸庆0焦.5骄u妄l拒反炸P1恒+P残2脾(5列0P释mo肥l/堤ul网)需解脖孝箩释块0.闷5+把0.赖5键ul匆葬士模板还冬醋震绢劲搂酿蠢厦欺茫沙予蛋氏2听ul送壮笔谊普健梢喊深注：没稍枪离心歼（4镰00饰0r挤/m赢in虫）洋循环仰参数芹94悉.5米℃雾崖(预威变性爬)士廉演挡2m哑in块94妈.5片℃钟圣(变分性)去贩哨作扑3撞0s惨洋挑55甩℃寿涂阿(退耍火)东捉散杰巾4界0s刚果72恩℃锤输优(延载伸)夫汇背总洪9门0s洁7匙2缴℃芬葛(菊终延煌伸)瞎典缸丛9任mi捐n本1.则3.肉3点泊膜澡通过泼微量欢点样壁器将炎所获顿得的序探针未点在狸预处习理的乳硝酸益纤维庭素膜浓上。些具体休矩阵向分布蓄见图良1.按。误图1棕：基被因芯炒片上驱探针戚的分撕布情镜况招阳性梯ND阔V苍AI豆V勉IB榜V火阳性慧ND局V推AI辽V烤IB队V纱阴性容IL犬T仗IB符DV优MD两V沾阴性扑IL仆T逢IB狱DV蒙MD嫌V雹1.梅4样熔品的鲁处理崭1.燕4.贺1短核酸宝的提字取清逗方法居同1丘.3衫.1肥1.趟4.铲2予核酸置的扩捎增吗方法掘，引患物，营循环糠参数班同1怎.3绳.2除，只轿是反侵映体丛系不众同。粘其反约应体说系如层下。鹊反应镜体系找：周H姜2优o慨霉刺姓亚杨万孟哭厨赏宴10巾ul絮B猛uf矮fe亏r状蚕助锹姑安攀需蹲吵过3矩ul拐合道脚Mg浑cl详2圾(2鸦5m妥M)丘渐列衬谎病金失4章ul葬惊折秋dN副TP县(2村.5象mM蓝)咐想购省广漂澡艘2.叉5u收l谎键崭掠Bi描ot议in庸-1奖1-股dU巾TP扑迷涉群待蹦右浆4u舅l厅地掠弃Ta方q(赠5U押/u箩l)孤扭贝鸣签惹姻胁会物1岁ul度围偶泡P晌a+砖Pb造(5霞0p怠mo孩l/倡ul巩)谢星典炎贴汪卡4u咸l录模板授绘颤装掩觉扔甲资际债扁倾2u抄l绿1.锦5楼杂交验俱加乒50泛0u壳l预将杂交陷液于矮基因攻芯片卫上，另42体℃屑处理龄40峡mi钳n引。取歇20便ul壶1其.4督.2草的产嗓物于炉1.绵5m涝l的完离心用管内帮,1亭00跃℃航变性赚10诞mi模n.秋-2贵0来℃项冷却朱5m悔in该,加套杂交卖液4棍50取ul涌,混酸匀,炸于基成因芯病片上未,4潜2寿℃搞杂交染1h浙。分斑别用研2暴×就SS宪C,准0.氧1始×仍SD工S和总0.炉1达×异SS怨C,给0.祖1洋×脚SD瞧S各烂洗三企次，把加4钱00幼ul脊3%右BS共A,列42冤℃箩封闭撤30拐mi脏n，陵45寄0u于l缓聋冲液迅中加吊1.恭6u鄙lA霉V-姻AP皂,4午2行℃坛酶联替20戏mi脊n，有先用黑洗涤摇液洗弃膜三型次,抄后加瞎入显迷色液商(4棵50守ul张底物躁液+盈1.敞6u赴lB际CI沾P+况1.绵6u闯lN冤BT洪),裕常温稀或4钳2挎℃绝显色阅3~侧5m摊in责。用持蒸馏袜水或咬自来粒水冲绳洗,腐终止目显色巨。虚1.扣6昌杂交雨结果冶的分珍析穴将杂赖交完搞毕晾旬干的国DN窑A阵迈列用更自制分的芯绍片扫焰描仪得进行纠扫描恨分析夺，根债据大技量样投品的俘分析健，设垂置读吼数0垦.1练以下舅为阴话性，贩0.翠2以换上为其阳性既，两贞者之砌间为彼可疑顽。打上印诊脆断报经告。志样品哗同时倍进行廊病原蹄分离车、H催I和兴PC肚R或雷RT蒜-P捉CR犯和其姥他检袍测方暗法进臭行比蜂较。茧阳性串和阴捷性对绞照:疮分为烫猪和娃鸡的舱血红露蛋白钩中珠团蛋白掀基因哲片段甜,加玉入反敌应系幅统,事以监冶视标圣记和纲杂交剪、显住色系不统是输否有丸效。厌表1浅：芯作片探子针的神引物旁设计勺病毒顿盒胳厨磁笑阿或演核鸟协苷强椅爸酸零痰序柔倾具列捏程衣脾卡锈说阵扎若垒犹产物毕长度蜡ND喝V桥P务5挤乡颂晋售臂倘旨个尸圾听5部’旨-C咬TT确G黑AC朗A况CC洲T愉CA樱T泉AC务T楚GT悦A葵T-肿3尤’摔62烦2橡P着3须骂尝辛漫暂趋搬塞恋简态5叮’栋-C陈CC西A稀AG疲C劝CA炒作TA交A厕TA推A疤GG违T奶CT肌T-配3挠’草AI亲V陷P想5坏还肠者炕痒浑沉暮还飞糟5笛’俩-C博TG申G膜TG贡C境AC普T恳TG挎C猪CA驻G允TT纹G奸-3罗’粒46胃4锐P芳3怎华着缝牵然茶络铲停将款5蹄’狠-G蒜AT献C眉AA翠G龙AA僵T垫CC笋A烘CA庙A覆TA敲T某C-满3桃’遭IB竹V折P地5贱浸只残射拼无旋蛛伍册医5脚’性-C树AT肆A雅AC厘T拌AA临C射AT和A殊AG斜G泰GC拖A问A-厕3替’忽60乔2熔P效3处副盗拍不础嚷崖翼琴情疗5户’娘-T罗GG场T他CC仙T肯CT颗T化CA泻A军GG娱T亮G-惑3陡’奏MD傍瞒P寒5套殃擦券纸种滴5孙’婶-G靠TT需C拴TA劫C鸣CG商G迫AC犬T辈GG但C拖GC疑T烤CG革-3两’计蛮染望嫩打来语肌别修4辞60涂P将3仇蛙液妖应徐脖5五–列AC同A结TT秤C劲TT封T学TC鱼G往TT师G续GC流G伪TG严G勺TA板T-臂3烤IL池T扶P唇5教乔寻花筛药押孟裂下斗阁5销’所-A焦CG伐A雁TG双A压CT脖C片CG午A昆CT挠T钓TC仙-3订’懒64吼3妇P足3邪系晓案馋概狠蹈系慢锻歪5耐’漫-C躺GT与T询GG庭A哲GG橡T嚷AG氏G尿TG拘G优TA勉-3干’壳IB惯DV惕P碧5专斜段堆灰夺如辣递颈营猜5沈’骗-G荐TC滤A辟TT走G勾AA心G映GC剑G认TG悔C烛GA硬G怜AA慧-3哀’巷51虎2珠P咱3直仿摩酒况混框蛛原剑亮缘5孤’帆-C绸AA愿烟GA树T鲜GG喝T绍AT碌T幅GG筋C岁GT既C以CT滩G-去3喜注：敢P免5费表示珠上游错引物笋，P归3蹲表示谣下游蕉引物盟。结果辞2.红1准秧确率贺检测铺的结呀果花我们准针对京性的起对缠ND蚀V猫AI衣V舞IB精V笑MD秧I傲LT蚀I键BD辉V毒债株分越别进使行了能检测上，杂燃交结漠果：唇六张蚊芯片痒分别探出现齿ND乳V趣AI灰V剥IB握V在MD雨I匹LT意I括BD帮V特敞异性维杂交肤点,土检测办结果刑皆为睬阳性扔，没著有非猛特异琴性杂宇交点思的出郊现。甲同时役阳性振对照袖明显忧,读义数大奇于0劲.3秒，阴班性对魄照则壤小于康0.贴1.吴2.矿2重脚复性妨检测有结果装同时冤各取该10叹管阳彼性毒井株进任行重总复性肚检测茅。结工果如爬表2径。屈表2拳秆睬谋住异屯猾旬倍买丰妇基忆因芯伤片规重复童性检同测结半果拐妥脏围极1巴监2损减3绸骨4能岔5有贡6腾腹7聚夹8尾昏9躁慌10覆尿阳妨性率婚ND练买向蚊+昨革+株雪+透恩+圈地+颈塔+号涌+延徒+豆飘+洽疲+登保免10青0％掀AI膀胶胳垄+眨策+熟描+阔奖+拳塑+身昌+吼击+效尤+平难+振呢+斗右逃10稠0％面IB施板另普+险拐+厕帜-津厉+乐掏+代怨+识宁+费猜+扔欺+戒瓶+茄谅慨90督％校MD希仔卵的+朴跳+杀浊+沸用+杀异+荷仍+询努+忠更+销筹+组屈+挺件波10撕0％旺IL赔T娱康念+扫绸+拐幼+堪章+巷判+颂赖+域训+捕浸+尊渠+巩躁+桐个拔10岭0%趟IB嘴D胜离绣+破举+祥猎+蹈晒+恼悼-灵识+纲欺+却钢+亲屡+传肯+毁中牌90逗%冲注：抖数字尖1～剧10吓为E傅pp盲nd缸or宏f管淹的编来号，丛“旁＋蜓”塞表示期阳性四，卖“哗－狠”盾表示泽阴性侦。煌2.英3检歼出率脉的检善测结隆果序对7嘴个鸡块场6户6个昆发病搁死亡塞病料泛分别格用病且毒分衡离、炒HI台、P承CR糊或R焦T-湾PC现R和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