TEM型超广谱β-内酰胺酶的体外定向进化研究的开题报告

TEM型超广谱β-内酰胺酶的体外定向进化研究的开题报告一、研究背景和意义：β-内酰胺类抗生素是当前临床特别常用也特别有效的抗生素之一，然而由于广泛而不合理的使用，极大程度上促进了β-内酰胺类抗生素的耐药性。而β-内酰胺酶是导致β-内酰胺类抗生素失效的最主要机制。此外，多重耐药菌的出现和传染形成了极大威胁。如何有效的抑制β-内酰胺酶的活性，增强β-内酰胺类抗生素的效果，并且具有广泛谱，已成为当前研究热点，对于抗菌感染的治疗具有重大意义。TEM型β-内酰胺酶是目前临床中发现最多的β-内酰胺酶。根据研究，TEM型β-内酰胺酶的结构以及机制已被详细阐述，TEM型β-内酰胺酶的抑制和活性的调节成为可行的研究方向。近年来，体外定向进化技术已经成为获得具有提高活性、谱广性和特异性的酶的有效方法。此外，体外定向进化技术还能通过在不同环境适应的途径中发掘酶的新功能，同时快速获得酶的活性突变体，是研究酶类分子在工业和生物医药等领域应用的关键方法。因此，在此基础上，通过对TEM型β-内酰胺酶的体外定向进化，寻求提高该酶的谱广性、特异性和活性的可能性，具有重要的理论和实践意义。同时，为探究抗生素耐药机制以及相关治疗方法提供了新思路。二、研究目标和内容：研究目标：通过体外定向进化技术，获得具有提高TEM型β-内酰胺酶活性和谱广性的酶分子研究内容：1.对TEM型β-内酰胺酶进行PCR扩增、克隆，构建酶基因库2.设计合适的寡核苷酸引物，进行定向进化实验，并优化反应条件3.通过微孔板进行初始筛选，选择活性更高，谱广性更强的高亲和力酶分子4.对筛选结果进行连接、转化和扩增，纯化获得高纯度、稳定性好的目标酶三、计划和进度安排：研究计划：第一年：1.完成TEM型β-内酰胺酶的PCR扩增和克隆2.设计和合成寡核苷酸引物，优化定向进化实验的反应条件3.构建微孔试验体系，选择合适的初始筛选浓度4.首轮扫描并初选获得高亲和力的酶分子，进行SecondSelection第二年：1.进行第二轮筛选，筛选出活性较高的酶分子2.进行进一步的体外分子进化（如引入随机单核苷酸突变、DNA重组等方法），获得更优化的酶分子3.对体外进化的酶分子进行酶学性质测定、比较与分析4.优化酶表达系统，扩大酶生产规模，获得足量的稳定，活性高的酶样品进度安排：第1年：1.1-2月：根据相关文献阅读和理论研究，完成TEM型β-内酰胺酶的PCR扩增和克隆2.3-6月：设计和合成寡核苷酸引物，优化定向进化实验的反应条件3.7-9月：构建微孔试验体系，选择合适的初始筛选浓度4.10-12月：首轮扫描并初选获得高亲和力的酶分子，进行SecondSelection第2年：1.1-3月：进行第二轮筛选，筛选出活性较高的酶分子2.4-6月：进行进一步的体外分子进化，并对进化的酶分子进行酶学性质测定、比较与分析3.7-9月：优化酶表达系统，扩大酶生产规模，获得足量的稳定，活性高的酶样品4.10-12月：编写论文，撰写毕业论文四、预期结果和应用前景：预期结果：成功获得具有提高TEM型β-内酰胺酶活性和谱广性的酶分子应用前景：1.为探究β-内酰胺酶的耐药机制提供了新思路。2.开发新