常规PCR实验演示文稿

常规PCR实验演示文稿当前第1页\共有33页\编于星期六\6点掌握：1、PCR的基本操作方法。2、琼脂糖凝胶电泳检测DNA的基本原理和方法。理解：1、PCR仪的使用方法。了解：1、PCR体外扩增的原理及其引物设计原则。2、扩增过程中各因素对扩增结果的影响。教学目的：当前第2页\共有33页\编于星期六\6点1、PCR反应体系的建立。2、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。教学重点：教学难点：

1、PCR反应程序的设计方法。当前第3页\共有33页\编于星期六\6点一、基本原理聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）：体外DNA酶促扩增技术，能特异高效地在体外扩增目的DNA片段。当前第4页\共有33页\编于星期六\6点PCR反应的基本步骤变性94˚C双链DNA模板被加热变性成两条单链退火45~60˚C（Tm-5˚C）寡聚核苷酸引物按碱基互补配对原则与单链模板DNA特异结合延伸72˚CDNA聚合酶作用下，以引物为起始，合成与模板DNA互补的新链当前第5页\共有33页\编于星期六\6点Cycle255555Primer15Primer2Cycle155TemplateDNAPCR技术的工作原理55555555当前第6页\共有33页\编于星期六\6点Cycle3555555555555555525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。当前第7页\共有33页\编于星期六\6点琼脂糖凝胶电泳原理把DNA样品加入到琼脂糖凝胶的样品孔中，并置于静电场上。由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。在电泳前向凝胶或样品中预加示踪染料，电泳过程中染料同DNA结合，电泳后在紫外光照射下，可观察到荧光，从而对分离的DNA进行检测。当前第8页\共有33页\编于星期六\6点二、操作步骤当前第9页\共有33页\编于星期六\6点模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶(如Taq酶)dNTPs反应缓冲液（含Mg2+）PCR反应的基本组分当前第10页\共有33页\编于星期六\6点10×PCR缓冲液（Mg2+

Plus）

5μldNTP混合物（2.5mM）

4μl上游引物（10μM）

2μl

下游引物（10μM）

2μlDNA模板

4μlTaqDNA聚合酶（2.5U/μl）

1μl去离子水

32μl实验步骤一：PCR反应体系的建立（重点）50μl2345671加样顺序当前第11页\共有33页\编于星期六\6点PCR反应程序的设计（难点）预变性：94℃5min

变性：94℃30sec

退火：55℃30sec

延伸：72℃40sec(60sec)

最终延伸：72℃5min

保存：4℃forever25cycles实验步骤二：PCR反应程序的设计当前第12页\共有33页\编于星期六\6点PCR程序设计的主要因素循环温度和时间Tm的概念：在双链DNA解链过程中，紫外吸光度的变化ΔA260达到最大变化值的一般时所对应的温度。Tm计算方法碱基数小于20：Tm=4×(GC%)+2×(AT%)碱基数大于20：Tm=81.5+0.41×(GC%)–

(675/引物长度)当前第13页\共有33页\编于星期六\6点主要实验仪器PCR仪当前第14页\共有33页\编于星期六\6点主要实验仪器PCR仪当前第15页\共有33页\编于星期六\6点实验步骤三：结果检测琼脂糖电泳检测PCR产物1.试剂：50×TAE电泳缓冲液：Tris242g，乙酸57.1ml，0.5mol/LEDTA（pH8.0）100ml，定容至1L，高压灭菌后备用。1×TAE电泳缓冲液：20ml50×TAE电泳缓冲液加入双蒸水，定容至1L。2.1％琼脂糖凝胶的配制：100mlTAE电泳缓冲液中加入1g琼脂糖，摇匀后放入微波炉中，小火加热几分钟至溶液透明位置，取出后冷却至56℃左右时，加入微量（3.5μL）的EB（溴化乙锭），混匀后倒入槽中，冷却后待用。当前第16页\共有33页\编于星期六\6点不同类型琼脂糖分离DNA片段大小的范围琼脂糖/％标准高强度低熔点0.30.5700bp～25kb0.8500bp～15kb800bp～10kb800bp～10kb1.0250bp～12kb400bp～8kb400bp～8kb1.2150bp～6kb300bp～7kb300bp~7kb1.580bp~4kb200bp~4kb200bp~4kb当前第17页\共有33页\编于星期六\6点3.上样反应结束后取5μL反应产物，加入1μL上样缓冲液（6×loadingbuffer），用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

指示剂：溴酚蓝Marker：DL2000。注意：

加样孔位于负极，DNA由负极向正极泳动40~60°当前第18页\共有33页\编于星期六\6点4.电泳电泳100V，10min左右。5.观察凝胶成像系统或紫外灯下观察结果（手套拿取凝胶）当前第19页\共有33页\编于星期六\6点三、注意事项1、注意移液枪的正确使用方法。2、按顺序逐一加入PCR反应体系各组分，切勿遗漏。3、取用各组分时，应避免污染和贴枪头壁损失。4、按操作步骤正确设置使用PCR仪。5、带手套操作实验。当前第20页\共有33页\编于星期六\6点四、影响PCR反应的因素1、模板任何来源的各种构型的含量极低的DNA样品都可作PCR的模板。

轻微的污染都会影响PCR的最终结果。2、脱氧核苷三磷酸（dNTPs）

4种dNTP在反应中浓度应相等，过高会抑制Taq酶活性，增加错配的几率。

当前第21页\共有33页\编于星期六\6点3、引物(引物的好坏是整个PCR反应的关键)引物浓度一般为0.1～0.5mmol/L，浓度太高，会增加非特异性扩增，形成引物二聚体；浓度太低，影响扩增效率和产率。*引物设计的原则长度15

～

30bpGC含量45

～

55%两条引物退火温度一致或接近，Tm差值小于5℃无连续核苷酸引物内部及引物间无互补，以免形成发夹结构和引物二聚体当前第22页\共有33页\编于星期六\6点特异性的引物：特异性的产物当前第23页\共有33页\编于星期六\6点4、Mg2+浓度Mg2+是DNA聚合酶发挥作用的必须成分；最适浓度一般为0.5-2.5mmol/L,浓度过低则无法启动反应，过高则影响产物特异性。

当前第24页\共有33页\编于星期六\6点5、TaqDNA聚合酶

具有5’→3’DNA聚合活性外，还具有5’→3’DNA外切活性。因此，在某些时候可选择具有校读活性的聚合酶例如Pfu；可以根据需要选择扩增长片段的Taq酶，高速扩增的Taq酶等反应终浓度以2～2.5U/100µl为最佳当前第25页\共有33页\编于星期六\6点五、问题分析当前第26页\共有33页\编于星期六\6点问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无M样品A样品B正对照当前第27页\共有33页\编于星期六\6点纯度：含有抑制物浓度：含量低质量：全长结构：二级结构

原因对策纯化模板或者使用优质试剂盒提取模板DNA加大模板的用量用好的反转录酶用温度高的反转录酶(1)无扩增产物之模板原因当前第28页\共有33页\编于星期六\6点引物错误引物设计不好引物降解引物合成、纯化不好

原因对策合成前检查评价、重新设计引物换一管新引物免费重新合成(2)无扩增产物之引物原因当前第29页\共有33页\编于星期六\6点退火温度延伸时间循环次数

原因对策递度PCR聚合酶的延伸速度适当增加循环数(3)无扩增产物之PCR条件原因当前第30页\共有33页\编于星期六\6点

现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带问题2：非特异性扩增M12当前第31页\共有33页\编于星期六\6点引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度偏低循环次数过多

原因对策重新设计引物或者使用巢式PC