动物性食品卫生学实验

实验一、菌落总数测定一、目的与要求1、学习掌握菌落总数测定的基本原理和方法；2、了解动物性食品上微生物的分布和繁殖动态。

当前第1页\共有111页\编于星期六\1点实验一、菌落总数测定二、实验说明

菌落总数（aerobicplatecount）是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。

菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。每种细菌都有它一定的生理特性，培养时应用不同的营养条件及其他生理条件（如温度、培养时间、pH、需氧性质等）去满足其要求才能将各种细菌都培养出来。但在实际工作中，一般都只用一种常用的方法去做。细菌菌落总数的测定，所得结果，只包括一群能在营养琼脂上发育的嗜中温性需氧菌的菌落总数。当前第2页\共有111页\编于星期六\1点实验一、菌落总数测定三、检验程序检样25g(mL)样品+225mL稀释液，均质

10倍系列稀释选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液各取1mL分别加入无菌培养皿内每皿中加入15mL～20mL平板计数琼脂培养基，混匀培养

计数各平板菌落数

报告

计算菌落总数当前第3页\共有111页\编于星期六\1点实验一、菌落总数测定四、操作步骤（一）样品稀释1、固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000~10000r/min均质1~2min，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1~2min，制成1:10的样品匀液。2、液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。当前第4页\共有111页\编于星期六\1点实验一、菌落总数测定四、操作步骤（一）样品稀释3、用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。4、按3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。当前第5页\共有111页\编于星期六\1点实验一、菌落总数测定四、操作步骤（一）样品稀释5、根据对样品污染状况的估计，选择2~3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。6、及时将15~20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。当前第6页\共有111页\编于星期六\1点实验一、菌落总数测定四、操作步骤（二）培养1、待琼脂凝固后，将平板翻转，36±1℃培养48±2h。水产品30±1℃培养72±3h。2、如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转平板，按1条件进行培养。当前第7页\共有111页\编于星期六\1点实验一、菌落总数测定四、操作步骤（三）菌落计数菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。1、选取菌落数在30~300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。2、其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。3、当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。当前第8页\共有111页\编于星期六\1点当前第9页\共有111页\编于星期六\1点实验一、菌落总数测定五、结果与报告（一）菌落总数的计算方法1、若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。2、若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：当前第10页\共有111页\编于星期六\1点实验一、菌落总数测定五、结果与报告（一）菌落总数的计算方法N=∑C/（n1+0.1n2）d式中：N——样品中菌落数；∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d——稀释因子（第一稀释度）。当前第11页\共有111页\编于星期六\1点实验一、菌落总数测定五、结果与报告（一）菌落总数的计算方法稀释度1:100（第一稀释度）1:1000（第二稀释度）菌落数（CFU）232，24433，35N=∑C/（n1+0.1n2）d=（232+244+33+35）/【2+（0.1×2）】×10-2

=544/0.022=24727当前第12页\共有111页\编于星期六\1点实验一、菌落总数测定五、结果与报告（一）菌落总数的计算方法3、若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。4、若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。5、若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。6、若所有稀释度的平板菌落数均不在30~300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

当前第13页\共有111页\编于星期六\1点实验一、菌落总数测定五、结果与报告（二）菌落总数的报告1、菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。2、菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。3、若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。4、若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。5、称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。

当前第14页\共有111页\编于星期六\1点动物性食品卫生学实验实验二、大肠菌群计数当前第15页\共有111页\编于星期六\1点实验二、大肠菌群计数一、目的与要求1、学习掌握大肠菌群计数的基本原理和方法；2、了解动物性食品的卫生状态。

当前第16页\共有111页\编于星期六\1点二、实验说明

大肠菌群(coliforms)是指在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。实验二、大肠菌群计数第一法：大肠菌群MPN计数法第二法：大肠菌群平板计数法当前第17页\共有111页\编于星期六\1点实验二、大肠菌群计数三、检验程序——第一法：大肠菌群MPN计数法检样25g(mL)样品+225mL稀释液，均质

10倍系列稀释选择适宜3个连续稀释度的样品匀液，接种LST肉汤管不产气产气BGLB肉汤36℃±1℃48h±2h不产气产气大肠菌群阳性36℃±1℃48h±2h查MPN表

报告结果

大肠菌群阴性当前第18页\共有111页\编于星期六\1点月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤成分：胰蛋白胨或胰酪胨氯化钠乳糖磷酸氢二钾（K2HPO4）磷酸二氢钾（KH2PO4）月桂基硫酸钠蒸馏水煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤

成分：蛋白胨乳糖牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液0.1%煌绿水溶液蒸馏水当前第19页\共有111页\编于星期六\1点实验二、大肠菌群计数三、检验程序——第二法：大肠菌群平板计数法检样25g(mL)样品+225mL稀释液，均质

10倍系列稀释选择2-3个适宜稀释度的样品匀液，接种VRBA平板计数典型和可疑菌落BGLB肉汤36℃±1℃48h±2h报告结果48h±2h36℃±1℃当前第20页\共有111页\编于星期六\1点

结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）成分：蛋白胨酵母膏乳糖氯化钠胆盐或3号胆盐中性红结晶紫琼脂蒸馏水当前第21页\共有111页\编于星期六\1点四、操作步骤——第一法：大肠菌群MPN计数法实验二、大肠菌群计数（一）样品的稀释

1、固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000~10000r/min均质1~2min，或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1~2min，制成1:10的样品匀液。2、液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。当前第22页\共有111页\编于星期六\1点四、操作步骤——第一法：大肠菌群MPN计数法实验二、大肠菌群计数（一）样品的稀释

3、样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。4、用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。

当前第23页\共有111页\编于星期六\1点四、操作步骤——第一法：大肠菌群MPN计数法实验二、大肠菌群计数（一）样品的稀释

5、根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。

当前第24页\共有111页\编于星期六\1点四、操作步骤——第一法：大肠菌群MPN计数法实验二、大肠菌群计数（二）初发酵试验

每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。当前第25页\共有111页\编于星期六\1点四、操作步骤——第一法：大肠菌群MPN计数法实验二、大肠菌群计数（三）复发酵试验

用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。当前第26页\共有111页\编于星期六\1点四、操作步骤——第一法：大肠菌群MPN计数法实验二、大肠菌群计数（四）大肠菌群最可能数（MPN）的报告按（三）确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表，报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。当前第27页\共有111页\编于星期六\1点四、操作步骤——第二法：大肠菌群平板计数法实验二、大肠菌群计数（一）样品的稀释

按第一法进行。当前第28页\共有111页\编于星期六\1点四、操作步骤——第二法：大肠菌群平板计数法实验二、大肠菌群计数（二）平板计数

1、选取2～3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。2、及时将15～20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3～4mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36±1℃培养18～24h。当前第29页\共有111页\编于星期六\1点四、操作步骤——第二法：大肠菌群平板计数法实验二、大肠菌群计数（三）平板菌落数的选择选取菌落数在15～150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。当前第30页\共有111页\编于星期六\1点四、操作步骤——第二法：大肠菌群平板计数法实验二、大肠菌群计数（三）证实试验从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36±1℃培养24～48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。

当前第31页\共有111页\编于星期六\1点四、操作步骤——第二法：大肠菌群平板计数法实验二、大肠菌群计数（四）大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以（三）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10-4

样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。当前第32页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验动物性食品卫生学实验当前第33页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验一、目的与要求1、学习掌握沙门氏菌检验的基本原理和方法；2、了解动物性食品检验沙门氏菌的意义。

当前第34页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验二、实验说明

沙门氏菌（Salmonella）是一群形态和培养特性都类似的肠杆菌科中的一个大属，也是肠杆菌科中最重要的病原菌属。沙门氏菌均有致病性。根据对宿主适应性不同，沙门氏菌分为三群：第一群具有高度适应性，只对人或某种动物致病；第二群在一定程度适应于特定动物；第三群非适应性，广泛感染的宿主谱，能引起人和各种动物的沙门氏菌病，具有重要的公共卫生学意义，占本属的大多数。

沙门氏菌的血清型表示方法是O抗原：第1相抗原：第2相抗原当前第35页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验三、检验程序225g（mL）检样+225mLBPW36±1℃8±18hBSXLD（或HE、显色培养基）1mL+SC10mL36±1℃18±24h1mL+TTB10mL42±1℃18±24h挑取可疑菌落36±1℃18±24h36±1℃40±48hTSI，赖氨酸，靛基质，尿素(pH7.2)，KCN

生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统+

H2S+靛基质-尿素-KCN-赖氨酸+H2S+靛基质+尿素-KCN-赖氨酸+H2S-靛基质-尿素-KCN-赖氨酸+/-

反应结果与左侧描述不符当前第36页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验三、检验程序甘露醇+、山梨醇+

ONPG-

非沙门氏菌沙门氏菌，血清学试验报告当前第37页\共有111页\编于星期六\1点BPW：缓冲蛋白胨水TTB：四硫磺酸钠煌绿增菌液SC：亚硒酸盐胱氨酸增菌液BS：亚硫酸铋琼脂XLD：木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂TSI：三糖铁琼脂KCN：氰化钾培养基ONPG：邻硝基酚β-D半乳糖苷培养基当前第38页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验四、操作步骤（一）前增菌称取25g（mL）样品放入盛有225mLBPW的无菌均质杯中，以8000～10000r/min均质1～2min，或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定pH值，用1mol/mL无菌NaOH或HCl调pH至6.8±0.2。无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36±1℃培养8～18h。如为冷冻产品，应在45℃以下不超过15min，或2～5℃不超过18h解冻。

当前第39页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验四、操作步骤（二）增菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mLTTB内，于42℃±1℃培养18h～24h。同时，另取1mL，转种于10mLSC内，于36℃±1℃培养18h～24h。

当前第40页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验四、操作步骤（三）分离分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于36℃±1℃分别培养18h～24h（XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板）或40h～48h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落。当前第41页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验BS琼脂：菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。当前第42页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验XLD琼脂：菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。当前第43页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验HE琼脂：蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。当前第44页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验沙门氏菌显色培养基：当前第45页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验四、操作步骤（四）生化试验1、自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h。当前第46页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验三糖铁琼脂赖氨酸脱羧酶试验培养基初步判断斜面底层产气硫化氢KA＋（－）＋（－）＋可疑沙门氏菌属KA＋（－）＋（－）－可疑沙门氏菌属AA＋（－）＋（－）＋可疑沙门氏菌属AA＋/－＋/－－非沙门氏菌KK＋/－＋/－＋/－非沙门氏菌注：K：产碱，A：产酸；＋：阳性，－：阴性；＋（－）：多数阳性，少数阴性；＋/－：阳性或阴性。沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果当前第47页\共有111页\编于星期六\1点本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。当前第48页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验四、操作步骤（四）生化试验2、接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h，按沙门氏菌属生化反应初步鉴别表（1）判定结果。将已挑菌落的平板储存于2℃～5℃或室温至少保留24h，以备必要时复查。当前第49页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验反应序号硫化氢（H2S）靛基质pH7.2尿素氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶A1＋－－－＋A2

＋＋－－＋A3－－－－＋/－注：＋阳性；－阴性；＋/－阳性或阴性。沙门氏菌属生化反应初步鉴别表（1）当前第50页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验四、操作步骤（四）生化试验2.1

反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按沙门氏菌属生化反应初步鉴别表（2）可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。

当前第51页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验pH7.2尿素氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶判定结果－－－甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）－＋＋沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特性）＋－＋沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果）注：＋表示阳性；＋表示阴性。

沙门氏菌属生化反应初步鉴别表（2）当前第52页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验四、操作步骤（四）生化试验2.2反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。

当前第53页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验四、操作步骤（四）生化试验2.3反应序号A3：补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。当前第54页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验四、操作步骤（四）生化试验2.4

必要时按沙门氏菌属各生化群的鉴别进行沙门氏菌生化群的鉴别。当前第55页\共有111页\编于星期六\1点项目ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ卫矛醇＋＋－－＋－山梨醇＋＋＋＋＋－水杨苷－－－＋－－ONPG－－＋－＋－丙二酸盐－＋＋－－－KCN－－－＋＋－注：＋表示阳性;－表示阴性。

沙门氏菌属各生化群的鉴别当前第56页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验四、操作步骤（四）生化试验3、如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据1的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。

当前第57页\共有111页\编于星期六\1点法国生物梅里埃ATB自动细菌鉴定仪微生物鉴定用试剂盒美国BILOG公司ELX808BLG自动细菌鉴定仪当前第58页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验四、操作步骤（五）血清学鉴定1、抗原的准备

一般采用1.2％～1.5％琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。

O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如2％～3％）培养基上再检查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接种在0.55％～0.65％半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3％～0.4％半固体琼脂的小玻管1次～2次，自远端取菌培养后再检查

。

当前第59页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验四、操作步骤（五）血清学鉴定2、多价菌体抗原（O）鉴定在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。

当前第60页\共有111页\编于星期六\1点玻板凝集试验当前第61页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验四、操作步骤（五）血清学鉴定3、多价鞭毛抗原（H）鉴定同2。4、血清学分型（六）结果与报告综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g（mL）样品中检出或未检出沙门氏菌。当前第62页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验五、聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。当前第63页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验五、聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）（一）原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。当前第64页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验五、聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）（一）原理DNA的体外复制类似于天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性——退火——延伸三个基本反应步骤构成。当前第65页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验五、聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）（一）原理1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4min，2～3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。当前第66页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验当前第67页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验五、聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）（二）反应五要素引物、酶、dNTP、模板、Mg2+1、引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。当前第68页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验五、聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）（二）反应五要素引物、酶、dNTP、模板、Mg2+2、酶及其浓度：目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。当前第69页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验五、聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）（二）反应五要素引物、酶、dNTP、模板、Mg2+3、dNTP的质量与浓度：dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris-HCL的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

当前第70页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验五、聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）（二）反应五要素引物、酶、dNTP、模板、Mg2+4、模板(靶基因)核酸：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。当前第71页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验五、聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）（二）反应五要素引物、酶、dNTP、模板、Mg2+5、Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。当前第72页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验五、聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）（三）反应条件温度、时间和循环次数。1、变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。当前第73页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验五、聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）（三）反应条件温度、时间和循环次数。2、退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。当前第74页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验五、聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）（三）反应条件温度、时间和循环次数。3、延伸温度与时间：一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。当前第75页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验五、聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）（三）反应条件温度、时间和循环次数。循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。。

当前第76页\共有111页\编于星期六\1点PCR扩增仪当前第77页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验五、聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）（四）电泳检测PCR扩增产物一般在48h以内进行检测，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。当前第78页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验当前第79页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验五、聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）（五）沙门氏菌检测步骤1、引物：P1：5'-ACTGGCGTTATCCCTTTCTCTGGTG-3'，P2：5'-ATGTTGTCCTGCCCCTGGTAAGAGA-3'；当前第80页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验五、聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）（五）沙门氏菌检测步骤2、反应体系：总体积为25μL，其中ddH2O15.25μL,10×PCRBuffer(含MgCl2)2.5μL，dNTP(2·5mmol/L)2μL，P1和P2(10μmol/L)各1.25μL，TaqDNA聚合酶0·25μL，模板DNA2.5μL。当前第81页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验五、聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）（五）沙门氏菌检测步骤3、反应条件：94℃，5min94℃，30s60℃，30s35次循环

72℃，45s72℃，10min当前第82页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验五、聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）（五）沙门氏菌检测步骤4、DNA的提取：将被检菌株接种于3mLLB肉汤中，37℃振荡培养(100r/min)18~24h后，取1mL培养液于1.5mL离心管中，经10000r/min4℃离心5min，弃去上清液，用200μLddH2O或者TE缓冲液(pH8.0)重悬沉淀，再于沸水浴中10min，随后立即在冰中冷却，然后在10000r/min及4℃条件下离心5min，取上清液为沙门氏菌基因组DNA模板。当前第83页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验五、聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）（五）沙门氏菌检测步骤5、电泳检测：取5μLPCR产物直接经1%琼脂凝胶（含0.5μg/mL溴化乙锭）电泳，凝胶成像仪上观察拍照结果。当前第84页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验21株沙门氏菌PCR扩增电泳图1-10，14-24为沙门氏菌分离菌株；12为DNAMarkerDL2000；11为沙门氏菌阳性对照；13为阴性对照当前第85页\共有111页\编于星期六\1点实验三、四沙门氏菌检验五、聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）（六）特点1、特异性强2、灵敏度高3、简便、快速4、对标本的纯度要求低当前第86页\共有111页\编于星期六\1点实验五、旋毛虫病检疫动物性食品卫生学实验当前第87页\共有111页\编于星期六\1点实验五

旋毛虫病检疫一、目的与要求1、学习掌握旋毛虫病的检疫技术；2、了解旋毛虫病的诊断要点和意义。

当前第88页\共有111页\编于星期六\1点旋毛虫病是由旋毛虫引起的人兽共患寄生虫病。成虫（肠旋毛虫）寄生在哺乳动物的肠内，幼虫（肌旋毛虫）寄生在肌肉组织中且形成包囊。多种动物均可感染，肉用动物中主要感染猪和狗。本病对人危害较大，可致人死亡。人旋毛虫病的发生主要是由于摄食了生的或未煮熟的含旋毛虫包囊的猪肉，其次是狗肉。实验五旋毛虫病检疫二、实验说明当前第89页\共有111页\编于星期六\1点当前第90页\共有111页\编于星期六\1点1、人和动物吞食了含有侵袭性旋毛虫（成熟的肌旋毛虫）而受到感染。2、旋毛虫成虫与蚴虫的发育同在一个宿主体内完成。寄生于宿主小肠（十二指肠、空肠）的成虫称肠旋毛虫；寄生于宿主肌肉组织中的蚴虫称肌旋毛虫。肌旋毛虫常寄生于膈肌、舌肌、喉肌、颈肌、肋间肌和腰肌等处，其中以膈肌感染率最高，且多聚积在筋头。3、实验证明形成包囊的旋毛虫和未形成包囊的某一生活阶段的蚴虫，均具有感染人和动物的能力。实验五旋毛虫病检疫当前第91页\共有111页\编于星期六\1点

人感染旋毛虫后，在病的初期出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻。随后表现乏力、畏寒、头痛、发热等类似感冒症状；并发生全身肌肉呈持续性痒痛，尤以下肢腓肠肌和腰部为明显；同时出现眼睑、面部乃至下肢浮肿。有的病人呈现脑炎、脑膜炎、心肌炎等症状。后期，急性炎症消退，除肌肉长期隐痛及四肢乏力外，一般没有什么症状；耐过患者经一定时间后体力完全恢复。实验五旋毛虫病检疫当前第92页\共有111页\编于星期六\1点宰前检验：ELISA（动物感染后大都有一定耐受力，往往不显症状。但感染严重的猪和狗，初期食欲减退，呕吐、腹泻，以后幼虫移行时可引起肌炎，病畜出现肌肉疼痛，麻痹，运动障碍，声音嘶哑，发热等症状）实验五旋毛虫病检疫宰后检验：主要是病原学检查法，其中仍以目检和镜检相结合的压片镜检法和集样消化法不失其实用价值。

当前第93页\共有111页\编于星期六\1点实验五

旋毛虫病检疫三、实验内容压片镜检法当前第94页\共有111页\编于星期六\1点⑴采取被检肌样：按规定自肉尸、胴体两侧横隔膜肌脚，各取样1份，每份（两块）重量不少于30-50克。与胴体、肉尸编成同一号码以便检疫对照。⑵目检：撕去隔肌膜，在充足的阳光下，仔细视检肉样表面有无半透明的隆起乳白色、灰白色小点。凡发现上述小点时，均应仔细剪下，制成压片镜检。实验五

旋毛虫病检疫当前第95页\共有111页\编于星期六\1点⑶压片标本制作：剪取小肉样制作压片。用剪刀顺肌纤维方向，按随机取样的要求，从检样肉上剪取米粒大小的肉24粒，均匀地在夹压玻璃片上排成两排，每排12粒。然后压片，放低倍（50-70倍）显微镜下检查。⑷镜检：先从压片一端第一块肉片（粒）的边沿开始，顺肌纤维全部观察，直到他端最后一块肉片为止。

实验五

旋毛虫病检疫当前第96页\共有111页\编于星期六\1点当前第97页\共有111页\编于星期六\1点肌旋毛虫肌旋毛虫当前第98页\共有111页\编于星期六\1点实验六布鲁氏菌病的检疫动物性食品卫生学实验当前第99页\共有111页\编于星期六\1点实验六、布鲁氏菌病的检疫1、学习掌握布鲁氏菌病检疫的基本原理和方法；2、了解血清学试验在布鲁氏菌病检疫中的作用。

一、目的与要求当前第100页\共有111页\编于星期六\1点实验六、布鲁氏菌病的检疫二、实验说明布鲁氏菌病（Brucellosis，又称布氏杆菌病，简称布病）是由布鲁氏菌属细菌引起的人兽共患的常见传染病。我国将其列为二类动物疫病。诊断：⑴流行特点，⑵临床症状，⑶病理变化，⑷实验室诊断（①病原学诊断a显微镜检查、

b分离培养

②血清学试验c虎红平板凝集试验RBPT、d全乳环状试验MRT、e试管凝集试验SAT、f补体结合试验CFT）当前第101页\共有111页\编于星期六\1点实验六、布鲁氏菌病的检疫二、实验说明结果判定

：1、具有⑴、⑵、⑶时，判为疑似。2、符合1，且a或b阳性时，判为患病动物。3、若为未免疫动物，则：

▲c或d阳性时，判为疑似。

◆b或e或f阳性时，判为患病动物。★符合▲但e或f阴性时，30天后应重新采样检测，c或e或f阳性的判为患病动物。

当前第102页\共有111页\编于星期六\1点实验六、布鲁氏菌病的检疫二、实验说明布病最常用的检疫技术是血清学诊断。目前我国常用的血清学方法有RBPT、SAT和CFT