双向电泳原理与流程

双向电泳原理与流程第一页，共六十五页，编辑于2023年，星期二Proteomics“...theanalysisofcompletecomplementofproteins.

Proteomicsincludesnotonlytheidentificationandquantificationofproteins,butalsothedeterminationoftheirlocalization,modifications,interactions,activities,and,ultimately,theirfunction."StanleyFields,UniversityofWashington,Seattle,inScience[291,1221(2001)]第二页，共六十五页，编辑于2023年，星期二Proteomics一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称为蛋白质组(proteome)仅仅从基因组学水平上无法彻底的了解各种生命现象,因为蛋白质才是生命活动的真正执行者

从基因组学上我们无法检测到转录后修饰、翻译调节、选择性剪切、以及蛋白复合物形成、蛋白质相互作用等生命现象;此外并不是细胞内的所有的DNA都翻译转录成蛋白质第三页，共六十五页，编辑于2023年，星期二ProteomeAnalysisandProteomics"TheanalysisoftheentirePROTEincomplementexpressedbyagenOME,orbyacellortissuetype."WasingerVCetal,Electrophoresis16(1995)“Proteomicsisthestudyofquantitativechangesofexpressionlevelsandtheirapplicationtodrugdiscovery,diagnosticsandtherapy.”Twobasictechnologies:2-DelectrophoresisofcomplexproteinmixturesIdentificationandstructureanalysisofproteinswithmassspectrometrymethods第四页，共六十五页，编辑于2023年，星期二Why2DE?Only“Proteomics”isthelarge-scalescreeningoftheproteinsofacell,organismorbiologicalfluid,aprocesswhichrequiresstringentlycontrolledstepsofsamplepreparation,2-Delectrophoresis,imagedetectionandanalysis,spotidentification,anddatabasesearches.Thecoretechnologyofproteomicsis2-DE.Atpresent,thereisnoothertechniquethatiscapableofsimultaneouslyresolvingthousandsofproteinsinoneseparationprocedure.第五页，共六十五页，编辑于2023年，星期二理论pIandMr

图

酵母细胞表达6,216种蛋白pI(理论值)Mr[kDa]2DE工作范围注:图片中没有特别强调蛋白丰度和疏水性至今1,484个蛋白被鉴定

(Nat.Biotechnol.17,676and19,242)From:Wildgruberetal.Electrophoresis21(2000)2610-2616.第六页，共六十五页，编辑于2023年，星期二2D电泳优越性对未处理样本耐受性好不需要预纯化(如：色谱层析)分辨率非常高2D可以有效的组分收集器蛋白在凝胶介质中受到保护在蛋白质组学技术中应用范围最广（front-end）与其他技术相比，在一次试验中可检测到的蛋白点更多

与后续分析技术兼容性好(如.MDLC)第七页，共六十五页，编辑于2023年，星期二蛋白质组学应用举例研究细胞结果功能和分子组成发现新的药物靶位点发现新型生物学活性的分子和药物差异蛋白质组学发现细菌、病毒感染和疾病监测的分子标志物修饰蛋白质组学遗传或药理学扰动的分子解剖病理生理学研究中药机理相互作用蛋白质组学研究药物作用方式和毒性机理植物抗虫抗旱抗逆遗传育种和分子育种资源环境海洋生物第八页，共六十五页，编辑于2023年，星期二寻找差异蛋白质环孢素A处理前环孢素A处理后正常组织肿瘤组织细胞组织第九页，共六十五页，编辑于2023年，星期二LifeSciences的历史LKB

——电泳发明者Pharmacia

——层析技术开创者AmershamBiosciences

——提供基因组、蛋白组学研究整体解决方案GEHealthcareLifeSciences

——实现从发现到功能研究，从体外到体内的突破 第十页，共六十五页，编辑于2023年，星期二GEHealthcaremilestonesin2-DelectrophoresisLKBintroducedAmpholine™,thefirstcommercialcarrierampholyteThefirstmultipleseparationsystem,ISO-DALT,wasdevelopedPharmaciaFineChemicalsintroducedPharmalyte™LKBintroducedImmobiline™PharmaciaBiotechintroducedImmobilineDryStripPharmaciaBiotechintroducedImageMaster™suitePharmaciaBiotechintroducedIPGphor™PharmaciaBiotechlaunchedDALTIIsystemAmershamPharmaciaBiotechlaunchedTyphoon™AmershamBioscienceslaunchedEttan™DIGE

TheMultiphor™flatbedelectrophoresisunitislaunched.Inproductionfor30yearsin2003!19671978197919821991199319982000200020021973第十一页，共六十五页，编辑于2023年，星期二第十二页，共六十五页，编辑于2023年，星期二ImageanalysisImageacquisitionAutomatedspotpickingSpotdigestionMALDItargetspottingLWSLaboratoryworkflowsystemMALDI-ToFProteinSeparationProteomics2DEWorkflowSamplePrepSamplelabeling第十三页，共六十五页，编辑于2023年，星期二

小鼠肝脏蛋白提取物2D凝胶电泳2-DelectrophoresisgelfromProf.Dr.A.Görg,TechnicalUniversityMunich,Germany第十四页，共六十五页，编辑于2023年，星期二2D/MS经典工作流程细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量差异分析双向电泳第一向第二向图像获取图谱分析银染

考染荧光蛋白标记样品制备分离染色图谱分析挖点酶解点靶蛋白鉴定体液植物微生物组织细胞第十五页，共六十五页，编辑于2023年，星期二样品制备细胞破碎蛋白沉淀溶解抑制蛋白酶活性去除

核酸

脂类

盐，缓冲液，离子性小分子

不溶性物质第十六页，共六十五页，编辑于2023年，星期二2D/MS经典工作流程差异分析图像获取图谱分析银染

考染荧光蛋白标记染色图谱分析挖点酶解点靶蛋白鉴定体液植物微生物组织细胞Separation双向电泳第一向第二向细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量样品制备第十七页，共六十五页，编辑于2023年，星期二Principleof2-DElectrophoresis1.Firstdimension:

denaturingisoelectricfocusing

separationaccordingtothe

isoelectricpoint2.Seconddimension:

SDSelectrophoresis

separationaccordingtothe

molecularweight

2-Delectrophoresisresolvesafewthousandproteinspots.第十八页，共六十五页，编辑于2023年，星期二等电聚焦电泳原理蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量随所处环境酸碱度的变化而变化。第十九页，共六十五页，编辑于2023年，星期二

等电聚焦（IEF）电泳就是在凝胶中加入两性电解质，从而构成从正极到负极pH逐渐增加的pH梯度，处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等电点。等电聚焦电泳原理第二十页，共六十五页，编辑于2023年，星期二双向电泳：传统方法sample胶在SDS缓冲液中平衡PrincipleaccordingtoP.H.O’FarrellandJ.Klose(1975)pH10pH10pH3pH3垂直胶管中进行等电聚焦urea,NP-40一向:二向:SDS丙烯酰胺凝胶电泳非连续梯度胶按等电点分离（电荷）按分子量分离（质量）第二十一页，共六十五页，编辑于2023年，星期二使用载体两性电解质IEF时存在的问题不同批次载体两性电解质的重现性载体两性电解质梯度不稳定蛋白载量有限重现性差导致梯度漂移梯度漂移导致酸性和碱性蛋白质丢失管胶柔软，尺寸不定操作者个人技术影响结果第二十二页，共六十五页，编辑于2023年，星期二固相凝胶(支持膜上0.5mm厚凝胶)丙烯酰胺缓冲液:Immobiline®

CH2=CH-CO-NH-R,R：羧基或叔胺基固相pH梯度(IPG)第二十三页，共六十五页，编辑于2023年，星期二Immobiline™

干胶条的特性可重复性无梯度漂移,真正的平衡方法可分离酸性和碱性蛋白

容纳蛋白样本量更多水平和垂直SDS凝胶中都能使用允许样本水化上样机械强度和尺寸稳定易操作易于对样本跟踪标记第二十四页，共六十五页，编辑于2023年，星期二新pH范围的Immobiline干胶条高分辨率的IPG胶条，联合使用DeStreak试剂,能改善极碱性区域蛋白点结果 。归功于独特的试剂。 使用pH范围相互重叠的干胶条，可提高2-D图谱分析效率!新pH范围:

Immobiline™DryStrippH3–5.6NLImmobilineDryStrippH5.3–6.5ImmobilineDryStrippH6.2–7.5ImmobilineDryStrippH7–11NLImmobilineDryStrippH3–11NL第二十五页，共六十五页，编辑于2023年，星期二不同pH范围胶条不同长度、多种窄pH范围胶条可选，尤其是1个pH范围pH7-11NL碱性胶条第二十六页，共六十五页，编辑于2023年，星期二宽pH、窄pH范围胶条宽pH梯度胶条应用:

整个蛋白图谱窄

pH梯度胶条应用:

提高分辨率

增加样品上样量

检测分析更多蛋白pH345678910456789第二十七页，共六十五页，编辑于2023年，星期二提高分辨率:斑点显现IPG4-7IPG5-6IPG4-7IPG5.5-6.7MouseliverproteinsFromA.Görgetal.(1999)第二十八页，共六十五页，编辑于2023年，星期二不同长度的胶条7cm11cm13cm18cm24cm第二十九页，共六十五页，编辑于2023年，星期二线形与非线形胶条formostsamples

Celllysates Tissueextracts linear(L)nonlinear(NL)forsampleswithabundantproteinsintherangebetweenpH5and7Serumproteins第三十页，共六十五页，编辑于2023年，星期二pH3-10LandNLfromProf.AngelikaGörg,TechnicalUniversityMunichTissueProteinsfromMouseLiverlinear(L)nonlinear(NL)第三十一页，共六十五页，编辑于2023年，星期二TheIPGphor™Platform第三十二页，共六十五页，编辑于2023年，星期二IPG胶条水化第三十三页，共六十五页，编辑于2023年，星期二IPGstriprehydration如果水化时加入样品，此体积是加入样品后的终体积第三十四页，共六十五页，编辑于2023年，星期二加样品到胶条槽第三十五页，共六十五页，编辑于2023年，星期二泡涨盘VS聚焦盘第三十六页，共六十五页，编辑于2023年，星期二干胶条的水化主动水化：胶条槽内进行，大分子蛋白更容易进入胶条；30－120V，10－24Hrs被动水化：专用水化盒中进行NEW！无需覆盖油！避免灰尘污染，空气作用不透明盖子，适用于CyDyeDIGE标记同时适用于市场上所有7－24cm干胶条的水化第三十七页，共六十五页，编辑于2023年，星期二在样品杯中加入少量不含样品的水化液检查是否漏液。上样前吸走水化液。上样前将样品离心去掉不溶物，每个样品杯最多可加样150μl。盖上胶条槽的盖子，再盖IPGphor仪器的盖子。分别将两个IEF电极片放在IPG胶条胶的两端，分别将电极压在两个电极片的外缘。样品杯可放在两个电极间除胶条槽内侧凸起外任何位置，对于碱性分离范围的IPG胶条，尽量将样品杯靠近阳极放置.杯上样&纸桥上样第三十八页，共六十五页，编辑于2023年，星期二IEF电泳IPGphor包括半导体温控系统(20°C)和程序化电源(10000V)可同时进行12根胶条的等电聚焦聚焦效果以“Vh”数控制，可提高重复性第三十九页，共六十五页，编辑于2023年，星期二IPG胶条的平衡——两步平衡SDS电泳前,平衡母液: 2%SDS,50mMTris-HClpH8.8,

6Murea,30%glycerol+

蛋白与SDS结合甘油和尿素降低电内渗作用第一步DTT平衡：(1x15min)1%DTT

第二步碘乙酰胺平衡：去除多余的DTT，防止拖尾(1x15min)2.5%iodoacetamide第四十页，共六十五页，编辑于2023年，星期二第二向垂直电泳系统

琼脂糖覆盖密封

放置IPGstrip低熔点琼脂糖第四十一页，共六十五页，编辑于2023年，星期二PushtheIPGStripDownontotheGelSurface第四十二页，共六十五页，编辑于2023年，星期二SealtheCassetteandFixtheIPGStripwithAgarose第四十三页，共六十五页，编辑于2023年，星期二InsertingtheCassette第四十四页，共六十五页，编辑于2023年，星期二SDS参数第四十五页，共六十五页，编辑于2023年，星期二SE600ruby第四十六页，共六十五页，编辑于2023年，星期二EttanDALTsix第四十七页，共六十五页，编辑于2023年，星期二EttanDALTtwelvesystem第四十八页，共六十五页，编辑于2023年，星期二第二向系统

strip gel number running length(cm) size(cm) ofgels time(hr)EttanDalt12 18,24 25x20 12 4.5EttanDalt6

18,24 25x20 6 4.5SE600 2x7,13 14x16(24) 4 4MiniVE 7 8x7,8x10 2 1.5MultiphorII 7,11 24x11* 1 1.5 18 24x18 1 3.3PhastSystem (4)** 4x4 2 0.5

*2or3stripsside-by-side **cutorhome-madestrip第四十九页，共六十五页，编辑于2023年，星期二2D/MS经典工作流程差异分析图像获取图谱分析蛋白标记图谱分析挖点酶解点靶蛋白鉴定体液植物微生物组织细胞分离细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量样品制备双向电泳第一向第二向银染

考染荧光染色第五十页，共六十五页，编辑于2023年，星期二ProteinDetectionMethods

第五十一页，共六十五页，编辑于2023年，星期二Coomassie™Blue-考马斯亮蓝染色+灵敏度，低至0.01mg(“胶体”考染)+非特异性染色+染料与蛋白成比例结合+线性化好扩散速度受限，胶的厚度影响跑胶速度纯度不够有限的动力学范围第五十二页，共六十五页，编辑于2023年，星期二胶体考马斯亮蓝染色1mgE.colistrainBIPGphor

24cmpH4-7ColloidalCBB

G250staining第五十三页，共六十五页，编辑于2023年，星期二银染+灵敏度，低至0.2ng+在凝胶基质中与蛋白交联+自动催化反应染凝胶表面蛋白

线性化程度比考染低一些大分子物质也被染色

步骤多，某些步骤时间控制严格第五十四页，共六十五页，编辑于2023年，星期二SilverstainedgelofE.coliLysate

IPG4-7SilverstainedwithPlusOne™KitwithoutglutaraldehydeandformaldehydeintheAgsol.第五十五页，共六十五页，编辑于2023年，星期二2D/MS经典工作流程差异分析蛋白标记挖点酶解点靶蛋白鉴定体液植物微生物组织细胞分离细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量样品制备双向电泳第一向第二向图像获取图谱分析银染

考染荧光染色图谱分析第五十六页，共六十五页，编辑于2023年，星期二ImageScannerIII图像扫描系统灰度校正功能平台具有防水功能，可直接扫描SDS湿胶。3.7OD高动态范围，保证高、低丰度蛋白的准确定量。扫描平台大，A3扫描面积，一次可扫描2块24cm凝胶。Gray256scaleTransmissive300dpi第五十七页，共六十五页，编辑于2023年，星期二由SIB,GeneBio和GEHealthcare合作开发，为SwissProt推荐分析软件。高效能参数自动找点，全自动蛋白定量计算方法，不受背景影响。在原始数据上进行分析，结果可靠。界面窗口可随意设计，界面极其友好。全自动凝胶匹配，采用先进的算法。根据点的相关因素、形状、位置、周围情况， 胶间匹配效率高。多种统计学分析工具，快速找到胶间蛋白表达差异。可直接链接到ExPASy®

和SwissProt