免疫病原微生物学进展

基因工程疫苗制备原理与产业化现状Lecture19重组疫苗（基因缺失疫苗）重组载活体疫苗重组亚单位疫苗基因疫苗转基因植物疫苗基因工程疫苗种类“标记”疫苗

基因添加疫苗

野病毒基因弱毒病毒基因非毒力基因鉴定克隆该关键基因至质粒将该关键基因与野毒株基因结合稳定低毒力基因

重组病毒构建原理（I)1.该类疫苗安全性好、不易返祖；2.免疫接种与强毒感染相似，机体可对病毒多种抗原产生免疫应答；3.免疫力坚实，免疫期长，局部接种，诱导产生粘膜免疫力;。4.缺失的基因及其编码的产物可作为一种检测标志用于免疫与感染动物的鉴别诊断。

基因缺失疫苗genedeletedvaccines优点:缺失与毒力相关基因及病毒复制非必需的基因常被缺失基因：胸腺激酶基因(TK)

痘苗病毒TK基因缺失单纯疱疹病毒(HSV)的22毒力基因缺失、TK基因缺失牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)TK基因缺失疫苗缺点是疫苗病毒具有潜伏性伪狂犬病病毒TK基因缺失苗

1986年获美国农业部批准投放市场缺失非必需基因

单复制周期病毒(Single-cycleviruses)

缺失的基因只是在病毒进入细胞时所必需病毒可完成其复制周期，也可从感染细胞释放出来，但释放的病毒无感染性缺失糖蛋白H基因的单纯疱疹病毒

复制缺陷型病毒(replicationdefectivevirus)

流产性感染（如：鸡痘病毒与金丝雀痘病毒）病毒复制早期蛋白基因，E1a缺失的腺病毒

缺失必需基因

如缺失gH糖蛋白的HSV突变株在免疫宿主的细胞中能完成一个复制周期，但在体内还是体外均不在细胞间传染，将此疫苗用于鼠模型中，可产生与野毒株感染一样强的免疫反应。能抵抗HSV-1强毒攻击，该疫苗的保护效果、细胞免疫水平比灭活苗高。单复制周期病毒产生的病毒特异性CTLs与野毒感染相同。基因缺失苗兼有弱毒疫苗及灭活疫苗的优点。伪狂犬病毒缺失疫苗：缺失gD基因的PRV虽可在动物体内细胞间传染，但不会在畜群间传播。

缺失越是后期必需的基因，诱发的免疫反应越强从cDNA克隆拯救感染性病毒

病毒全长感染性cDNA克隆技术反向遗传操作技术(ReverseGenetics)

“病毒拯救(rescueofvirus)

重组病毒构建原理（II)“分段克隆”策略：将病毒基因组各片段顺次克隆。低拷贝载体：复制严谨性较高沉默突变：在构建cDNA克隆时，一般均在一处或几处合适的位置上进行沉默突变，便于鉴定拯救出的病毒。基因组3’末端和5’末端的克隆采用cDNA末端快速扩增法(RACE)

基因组全长片段的克隆Menlenbarg等（2000，2003）NSPGP2GP3GP4GP5MN

FMDV蛋白酶2A基因

人A型流感病毒HA基因抗原表位

感染性cDNA克隆举例

mRNABHK21细胞病毒子接点插入位点PRRSVNDV--微型基因组的构建与共转染启动子病毒基因组片段病毒前导序列尾随序列辅助重组质粒NP、P和L蛋白共转染微型基因组流感病毒:NP、PB1、PB2、PA

Menlenbarg等（2000，2003）NSPGP2GP3GP4GP5MN

FMDV蛋白酶2A基因

人A型流感病毒HA基因抗原表位

感染性cDNA克隆举例

mRNABHK21细胞病毒子接点插入位点PRRSV病毒复制非必需片段基因鉴定病毒复制非必需片段基因克隆外源基因插入非必需片段基因中间(即重组载体)将病毒基因和重组载体基因共转染至细胞，同源重组，产生感染性病毒粒子筛选稳定的重组病毒重组病毒活载体研制原理重组病毒载体

痘病毒载体

(fowlpox,canarypox)

疱疹病毒载体杆状病毒载体腺病毒载体

RNA病毒

NDV，PRRSV，PoliovirusSindbisvirus(Alphaviruses)

痘病毒载体基因组容量大、含多个非必需区基因，适于插入多个外源基因(可达40kb)，易于构建，表达水平高。宿主范围广、增殖滴度高、抗原性稳定，免疫原性持久，能够同时诱发体液和细胞免疫，相对安全。

缺点：种痘后局部反应较大。(百万分之一)

抗原性强，不能多次使用。禽类痘病毒，引起顿挫型感染，但却可以持续表达外源基因，并且不影响再次接种

痘病毒载体①启动子②外源病毒结构蛋白基因③终止子④非必需区同源序列痘病毒载体构建时，应考虑的主要因素①启动子痘病毒与其他大多数DNA病毒不同，是在胞浆内复制，病毒DNA转录时，必须靠其自身合成的RNA聚合酶，因此在痘病毒内表达外源基因时，必须使用痘病毒自身的启动子。在痘苗病毒和禽痘病毒载体构建时，外源基因前多使用来自于痘苗病毒的早期启动子P7.5，或晚期启动子PL11。②外源病毒结构蛋白基因由于痘病毒不具有编接机制，外源病毒结构蛋白基因应为其连续编码区，不能有内含子或间隔区。③终止子为了不影响痘病毒载体基因的正常表达，在使用早期启动子时，在3′末端加上早期基因转录终止子T5NT；采用晚期启动子时不必考虑终止子问题，晚期启动子的转录可在痘病毒基因组中被终止。痘病毒不识别其他真核基因的转录终止子。④非必需区同源序列由于将外源性病毒基因导入痘病毒的机制是同源重组，因此，在构建载体时，必须在外源目的基因及启动子两侧带有痘病毒基因组的同源序列。同源序列一般取自于病毒复制非必需区，这样可以保证病毒的复制能力不受影响。痘病毒载体中表达的外源基因V.VHIVgag/pol，core，gp160，envFPVNDVHA/NA，Fusion，Fusion/HA/NPV.VPRVgp50/gp63,gp50/63/I/XCPVMeaslesF/HA,FusionV.V/CPVRabiesGV.V.InfluenzaHAFPVIBDVVP2V.V.FLVenv表达狂犬病病毒G蛋白的重组痘苗病毒表达牛瘟病毒F和HA蛋白的重组痘苗病毒疫苗表达新城疫病毒F和HN蛋白表达禽流感病毒的HA和NP蛋白马立克氏病毒SB糖蛋白禽白血病囊膜蛋白传染性法氏囊病病毒VP2蛋白牛白血病病毒膜蛋白猫白血病毒膜蛋白牛病毒性腹泻病毒E2蛋白禽网状内皮增生症病毒囊膜蛋白痘病毒活载体疫苗举例

人Ad2和Ad5：外源基因容量为20kb左右。

E3：病毒复制的非必须区，允许插入的外源基因的最大长度为4.0Kb。外源基因一般不需要加基因表达调控元件，利用腺病毒本身的调节元件，即外源基因可插在E3启动子后,在感染早期有效表达。[HSsAg、HIV-1、狂犬病毒]E1：为病毒复制必须区。缺失E1区的人腺病毒必须在特殊的工程细胞中（比如293细胞系（人胚肾细胞））或非缺失的腺病毒辅助下才能复制增殖，因此称为病毒缺陷型载体。腺病毒载体腺病毒载体优点

腺病毒比较安全。腺病毒的靶细胞范围广:复制分裂细胞、非复制分裂细胞。腺病毒容易制备，对热不敏感，高滴度增殖。腺病毒可以在肠道及呼吸道繁殖，能诱导粘膜免疫，能制成药囊经口服途径接种以预防消化道及呼吸道感染。

Ad2、Ad5等启动子较强，能高水平表达外源基因，特别是换以更强的启动子如CMV早期启动子后，更可明显提高外源基因的表达水平。常规的构建方法：

在E1区插入一个表达盒：包括启动子、外源基因和polyA序列

启动子：巨细胞病毒(CMV)早期启动子

Rous肉瘤病毒(RSV)长末端重复(ITR)/增强子序列，腺病毒主要晚期启动子(MLP)和三联先导序列(TPL)。表达盒的方向对于表达不太重要，但有文章报道以CMV早期启动子的表达盒右向表达β-gal比反向的表达的高7倍。缺失E1的病毒载体安全E3区编码的gp19蛋白降低感染细胞MHC-I类抗原的表达，因而缺失该基因的载体可以更有效地将外源基因提供给宿主免疫系统B型肝炎病毒、呼吸道合胞体病毒

HIV、SIV

水疱性口炎病毒狂犬病病毒牛副粘病毒3型牛疱疹病毒I型牛冠状病毒猪传染性胃肠炎病毒

重组腺病毒构建成功举例基因组较大，约150kb，含70个编码基因，其中至少20%的基因是非必需基因，可容纳多个外源基因的插入。大多数疱疹病毒的宿主范围很窄，其重组病毒的使用不会产生流行病学方面的不良后果(伪狂犬病毒除外)

。许多疱疹病毒经粘膜途径感染，构建的载体活疫苗可经粘膜途径提呈抗原，诱导特异性粘膜免疫。疱疹病毒作为活载体表达外源基因作为疫苗的研究：

疱疹病毒载体火鸡疱疹病毒活载体

NDVF和HN基因，

HVT/MDVgB重组病毒:CEF:2.2×105PFU/ml。

HVT/缓发型NDVHitchnerB1株的F和HN基因

HVT/IBDVVP2基因。疱疹病毒活载体的应用

猪伪狂犬病病毒弱毒株构建活载体疫苗口蹄疫病毒VPl基因猪瘟病毒E2基因猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因猪流感病毒HA基因牛I型疱疹病毒

FMDVVP1基因、PRV的gⅢ基因鸡传染性喉气管炎病毒禽流感病毒HA基因疱疹病毒活载体的应用

脊髓灰质炎病毒(PV)疫苗安全、可口服，易增殖，滴度高。

PV表达的外源性病毒蛋白以嵌合的形式存在于病毒颗粒表面可以构建成多价载体疫苗病毒基因组容量较小，插入的外源基因片段大小有限插入不当会造成致死性突变形成的嵌合体病毒增殖较慢外源性病毒抗原的免疫原性较弱

PV-人免疫缺陷病毒、PV-人乳头瘤病毒嵌合体病毒

PV-FMDV嵌合体病毒小RNA病毒载体

负链RNA病毒，RNA没有感染性，不能自行复制。流感病毒核糖核蛋白体(RNP)的重组及转染系统，可以使重组的RNA能够复制并具有感染性，即用提纯的病毒转染进已被辅助病毒感染的细胞。流感病毒可以同时诱导体液免疫和细胞免疫，并能产生

IgA介导的粘膜免疫流感病毒载体

反转录病毒生活周期中，病毒RNA反转录为前病毒DNA，并整合到宿主细胞的染色体中，因此，同其它RNA病毒相比，构建感染性前病毒分子克隆相对容易。基因组8～10kb，非必需区很小，外源基因的容量很小。可作为将外源基因导入体细胞的工具，用于基因治疗。表达禽流感病毒的血凝素(H7)基因，免疫鸡用强毒株H7N7

攻击后完全获得保护。

反转录病毒载体①生产成本和接种使用成本低，类似于常规弱毒疫苗；②能真实地再现外源基因编码蛋白后的抗原性，并能全方位地激发免疫应管，包括细胞介导免疫，体液免疫以及局部规模免疫；③提呈免疫的单一性类似亚单位疫苗，但不需佐剂，如果载体病毒安全，则不会引起疾病；④免疫接种和自然感染动物，用特异性诊断试剂可进行鉴别；⑤在同一病毒载体中插入多种免疫原基因，可构建多价疫苗。具备活疫苗的免疫效力和低成本及灭活疫苗的安全性。病毒活载体疫苗优缺点小结优点病毒活载体疫苗的缺点：使用同一载体的不同疫苗不能同时使用解决办法：①构建多价疫苗②构建多种可用的载体③建立合理的免疫程序病毒活疫苗、灭活疫苗及病毒活载体疫苗配合应用。

格氏链球菌、木糖链球菌：人的皮肤共栖菌，可作为表面定居的融合蛋白载体乳酸杆菌：肠道和阴道内的共栖菌，但出现时间很短。肠道菌（大肠杆菌、霍乱弧菌、结肠耶耳森氏菌、志贺氏菌）

大肠杆菌/TGEVS蛋白的融合蛋白，CS31A:腹腔注射免疫鼠（加佐剂）刺激产生显著的血清抗体应答。大肠杆菌/艾美球虫子孢子蛋白的118氨基酸与β-半乳糖苷酶融合:接种鸡，可产生保护性免疫应答。4.沙门氏菌

细菌性活载体

能运送抗原至肠道的淋巴组织，并引起分泌免疫反应，其中分泌性IgA浸润所有的粘膜表面及外分泌腺体的分泌物中。伤寒沙门氏菌在人体、鼠伤寒沙门氏菌在小鼠能在寄主肠道中定居，并在肠道淋巴组织、肝和脾中增殖。沙门氏菌人工突变后，它们仍能在肠道淋巴组织中定居。可用于表达各种定居因子、毒性抗原基因的载体，以递呈这些抗原到肠道淋巴组织。沙门氏菌活疫苗载体

基本特性营养缺陷质粒补救系统

该系统的寄主是某一营养代谢物的染色体突变株，而转移质粒则带有与寄主突变互补的非同源基因。整合表达系统细胞表面表达系统鞭毛表达系统。

沙门氏菌活载体表达系统FMDVVP1基因的10个氨基酸残基的DNA片段嵌合到

E.coli.K-12菌株的外膜蛋白基因中，实现融合蛋白表达

E.coli外膜蛋白(Lamb)-乳多空病毒的VPl抗原决定簇乙肝病毒的S2的两个抗原决定簇DNA片段-E.coli菌体

FMDV多肽-E.coliP4菌株纤毛大肠杆菌载体疫苗肠毒素性大肠杆菌(ETEC)-产气荚膜梭菌p—毒素(羔羊痢疾、犊牛肠毒血症等)的基因工程重组细菌毒素疫苗宁夏大学王玉炯已完成全部实验室试验和田间试验在宁夏、内蒙、辽宁、山东和吉林等省进行区域性试验，受试羊53000只，受试牛12000头免疫保护率达到90％以上该疫苗正在申请新兽药证书，即将进行规模化生产。幼畜腹泻双价基因工程苗

转基因植物表达的抗原蛋白经纯化后仍保留了免疫学活性，注入动物体内能产生特异性抗体；用转基因植物组织饲喂动物，转基因植物表达的抗原递呈到动物的肠道相关淋巴组织，产生粘膜和体液免疫应答。

转基因植物疫苗（transgenicplantvaccine）食用疫苗（ediblevaccine）

1.整合表达系统：把编码病原体保护性抗原基因导入植物细胞内，并整合到细胞染色体上，形成表达疫苗的植物品系。2.瞬时表达系统：用植物病毒为载体，将编码疫苗抗原的基因插入植物病毒基因组中。再用此重组病毒感染植物，抗原基因随病毒在植物体内复制、装配而得以高效表达。转基因植物基因工程疫苗的表达系统安全性好：疫苗中不含传染性材料，接种后不会发生急性、持续或潜伏感染，可用于不宜使用活疫苗的一些情况。减少或消除了常规疫苗有害的反应原：热原、变应原、免疫抑制原等稳定性好：便于保存和运输，产生的免疫应答可以与感染产生的免疫应答相区别，因此更适合于疫病的控制和消灭计划。将高度危险和致病的病原体的免疫原性蛋白质编码基因转移到不致病而且无害的微生物，用于大量生产，安全性更好。可用于外来病病原体和不能培养的病原体。优点：重组亚单位疫苗构建原理

保护性抗原的基因原核或真核表达载体

原核或真核细胞

保护性抗原肽链

重组亚单位疫苗佐剂

表达系统：

原核生物：E.coli；枯草杆菌（Bacillussubtilis）酵母真菌昆虫细胞(杆状病毒)

哺乳类细胞关键：研究和了解在各种表达系统中基因表