纳米稀土荧光材料与时间分辨荧光免疫分析硅胶包裹纳米铽荧

纳米稀土荧光材料与时间分辨荧光免疫分析作者：叶志强,谭明乾指导教师：袁景利,王桂兰摘要：在油包水型的微乳液中，合成了三种形状规则、尺寸均匀的硅胶基质纳米稀土荧光材料。与前驱体相比，新型荧光纳米微粒具有更强的荧光强度和抗光漂白性能。将纳米微粒表面修饰并标记链酶亲和素SA(或抗体)后应用于时间分辨荧光免疫分析，建立了人血清中前列腺特异抗原(PSA)、甲胎蛋白(AFP)和乙肝表面抗原(HBsAg)的高灵敏度检测方法。关键词：荧光纳米微粒；稀土配合物；生物标记；时间分辨荧光免疫分析。时间分辨荧光生物分析技术是基于稀土荧光化合物特殊荧光性质而建立起来的一种高的领域1。该技术利用具有荧光寿命长、Stokes位移大和半峰宽窄等特点的稀土荧光配合物作为标记物，不仅适用于多标记分析，而且可完全消除各种散乱光和短寿命荧光对测定的干扰，从而实现超高灵敏度分析。基于这些优点，时间分辨荧光生物分析技术在近20年来取得了重大的发展，在临床医学与生命科学的实践与研究中发挥着重要的作用。是由于纳米尺度的发光粒子的瑞利、拉曼和丁达尔散射产生的背景光对测定的严重干扰,影响了检测在我们的研究中，综合稀土荧光标记物和纳米技术的优势，合成了三种具有长寿命荧光的纳米稀土荧光微粒5-7。新型纳米荧光微粒用于时间分辨荧光生物分子分析，不仅可从根本上彻底消除各种散乱光和短寿命荧光对测定的干扰，提高分析方法的灵敏度,而且由于荧光配合物被包覆在硅胶的骨架结构中,基本隔绝了外部环境对配合物的影响，极大地增强了荧光材1.掺杂型纳米荧光微粒的制备将160mgN,N,N1,N1-[2,6-bis(3’-aminomethyl-1’-pyrazolyl)-phenyl-pyridine]tetrakis(acetate)-Tb3+(BPTA-Tb3+)溶于ml的水后和200μl的四乙氧基硅 结束反应。将反应液离心后除去上清液，沉淀部分用乙醇和二次蒸馏水各洗三次，真空干燥后得到白色硅胶包裹BPTA-Tb3+纳米荧光微粒。2.掺杂型纳米荧光微粒用于测定人血清样品中的PSA注于96微孔板的各孔中，4oC,24小时包被后，将PSA标准溶液(用5%%%NaN的pH值的3应后，用含有%Tween20的pH值的mol/LTris-HCl缓冲溶液(缓冲溶液1)洗两次，再用pH值的mol/LTris-HCl缓冲溶液(缓冲溶液2)洗一次，然后加入45μl生物素标记的抗3.共聚合型纳米荧光微粒的制备微乳液。室温搅拌反应5小时后，加入6μl的时后，加入50ml丙酮结束反应。将反应液离心后除去上清液，沉淀部分用乙醇和二次蒸馏水分别洗三次，真空干燥后得到白色的共聚合型硅胶包裹BPTA-Tb3+纳米荧光微粒。4.共聚合型荧光纳米微粒用于测定人血清样品中的AFP行固相时间分辨荧光测定。5.共价键合型荧光纳米微粒的制备将mg氨丙基三乙氧基硅(APS，47?mol)，?mol4,4-bis(1",1",1",2",2",3",3"-heptafluoro-4",6"-hexanedion-6"-yl)-chlorosulfo-o-terphenyl(BHHCT)及?molEuCl?6HO加入30μl环己烷中，超声振荡反应15分钟后，反应液加入到32将反应液离心后除去上清液，沉淀部分用乙醇和二次蒸馏水分别洗三次后悬浮于水中备用。6.共价键合型纳米微粒用于人血清中乙肝表面抗原(HBsAg)测定使用抗HBsAg单抗和多抗进行测定，测定步骤与掺杂型纳米荧光微粒测定人血清中PSA相同。1.掺杂型纳米荧光微粒的制备及时间分辨荧光免疫测定PSA掺杂型纳米荧光微粒的制备原理见图1。在表面活性剂和助表面活性剂的作用下，含有TEOS,BPTA-Tb3+的水溶液在油相中形成均匀的小液室，每一个小液室相当于一个微反应器，TEOS的水合化和聚合化的过程都被限制在微反应器内。微反应器的体积主要由水和表面活性剂的比值所决定，而微反应器的体积大小又决定了纳米颗粒的尺寸大小。我们用这种方法制OilOilCosurfactantmolculestantmoleculesSiOSiNH4OH,PolymerizationBPTA-Tb3+SiOSiOTbOSi(OEt)WaterPool4图1在微乳液中制备纳米微粒的原理图2硅胶包裹BPTA-Tb3+纳米微粒的电镜照片纳米荧光微粒表面的硅胶经过修饰后可与生物分子相连。将纳米荧光微粒与SA共价结合方法主要有放射性免疫法和酶联免疫法，它们的检测灵敏度大约在100pg/ml左右。而最近udr的研究表明，如果方法的检测灵敏度可达到20pg/ml以下，那么至少可以提前一年诊断出治疗后前列腺癌患者是否复发。所以发展高灵敏度的血中PSA的检测方法显得十分重要。使用的PSA浓度进行了测定，并与临床测定的结果进行了比较，两者的相关性见图4。两种方法对24个人血清样品中PSA浓度测定结果的相关性方程式为y＝＋，相关系数为，说明使用纳米微粒作为标记物的测定方法的结果是完全可信的。uuoco1030.0010.010.1110100AS864204681012142.共聚合型纳米荧光微粒的制备及时间分辨荧光免疫测定AFP性基团-NH2在聚合后会存在于纳米微粒的表面，为后续标记生物分子提供极大的方便。所以，在我们的研究中利用将AEPS和TEOS共聚合的方法在微乳液中制备出了表面带有活性氨基的功能性硅胶包裹铽配合物纳米荧光微粒。其电镜测定结果(见图5)显示这种纳米微粒不仅形状规则，而且粒径分布范围窄(45±3nm)。聚合后存在于纳米微粒表面的-NH2基团使得生物AFP合后，建立了一种以纳米微粒为的最低检测限为ng/ml，相对标准偏差(CV%)小于%，血清添加回收率在范围，说明该法具有较高的精密度和准确度，可以用于人血清样品的测定。1105u1041030.1110100Conc.ofAFP(ng/ml)u3.共价键合型纳米荧光微粒的制备及时间分辨荧光免疫测定HBsAg纳米微粒时只有少量的配合物被包进纳米微粒中，导致制得的纳米微粒荧光很弱。而采用共ll微粒的荧光强度得到大幅度提高，而且一次性地在纳米微粒表面导入了自由氨基。电镜测定结果(见图7)显示该法制得的纳米微粒大小均匀，粒径为37±3nm。 (a)(b0.1SA(a)和BHHCT-Eu3+标记SA-BSA(b)测定人血清中HBsAg的工作曲线将纳米微粒与SA结合后，用于时间分辨荧光免疫测定人血清中的HBsAg，其工作曲线的测定方法(图8b，最低检测限为84pg/ml)。该法用于人血清样品测定的相对标准偏差小于本研究利用微乳液法制备了三种硅胶基质纳米稀土荧光微粒，制备方法简单且重复性好。所制备的纳米微粒形状规则、尺寸均匀，在对其进行表面修饰后用于生物标记及时间分辨荧荧光微粒具有强荧光、强抗光漂白性能及易用于生物标记等优点，预计其在荧光显微镜生物成像测定及生物芯片等领域也有重要的应用前景，这部分的研究工作将在近期展开。领域前沿项目－大连化物所青年基金资