染井吉野樱组培育苗技术规程

染井吉野樱组培育苗技术规程1范围本标准规定了良种染井吉野樱（Prunus×yedoensis）组培育苗中的普通术语、组培育苗过程中外植体材料的选择、消毒灭菌、初代培养、继代培养、生根培养、炼苗移栽、管护、运输等方法及技术档案管理。本标准适用于染井吉野樱在全国范围内的工厂化组织培养育苗生产作业。2规范性引用文件下列文件对于本标准的应用是必不可少的。GB/T14071-1993林木良种审定规范NY/T2306-2013花卉种苗组培快繁技术规程GB3095环境质量标准LY/T2289林木种苗生产经营管理档案中华人民共和国国务院令第645号危险化学品安全管理办法3普通术语下列术语适用于本文件。3.1植物组培planttissueculture将从植物体分离出的符合需要的组织、器官或细胞及原生质体等材料，通过无菌操作接种在含有各种营养物质及植物激素的培养基上进行培养以获得再生的完整植株的技术。3.2接种inoculation将消毒后的外植体或干净培养材料在无菌条件下接入培养容器内培养基中的过程。3.3消毒disinfection通过物理、化学方法去除物体表面大部分有害病原微生物（孢子除外）的过程。3.4灭菌sterilization通过物、化学及一些理化方法杀灭一切微生物（包括孢子等）的过程。3.5外植体explant从自然生长的活体植物上获取的用于建立植物组培快繁体系的起始材料。3.6初代培养primaryculture指直接从机体取下的细胞、组织和器官等材料的培养。3.7继代培养subculture将培养材料从老培养基中转接入新鲜培养基中继续培养的过程。3.8生根培养rootingculture将继代增殖后的无根芽苗转接至生根培养上诱导生根培养得到完整的植株的过程。3.9组培工厂planttissuecultureproductionlaboratory利用植物组织培养技术大规模生产植物组培苗的工厂。3.10炼苗acclimatization

炼苗是在保护地育苗的情况下，采取放风、降温、适当控水等措施对幼苗强行锻炼的过程。4组培4.1外植体材料选择从健壮母树上截取半木质化的单芽茎段或顶芽作为外植体材料。4.2消毒灭菌先用洗衣粉水浸泡20-30min，再轻轻清洗外植体表面将其表面的尘土和部分有害病原微生物去除，然后用流动的自来水冲洗2-4h后置于超净工作XX；在鼓风状态下于超净工作台上先用质量分数70-75%乙醇消毒8-15s后用无菌水清洗3-6次，再用质量分数15%次氯酸钠溶液消毒8-15min后用无菌水洗4-6次，最后用无菌纱布或无菌滤纸吸干外植体表面水珠后待用。所用消毒剂遵照GB3095执行。4.3初代培养cm小段并接种到芽诱导培养基（MS+BA0.5-1.0mg/L+NAA0.02mg/L+TDZ2.0－3.0mg/L+蔗糖20－30gmg/L）中，先在22-25℃条件下全暗培养5-7d，然后置于每天光照10-12h，光照强度1500~2000lx的培养室中培养，25d左右继代一次，直至诱导形成丛生芽。4.4继代培养mg/L）上进行继代培养，接种后置于每天光照10-12h，光照强度为2000lx，培养温度22-25℃的条件下培养，多次反复切割进行继代培养，得到健壮丛生芽。4.5生根培养mg/L）中进行生根培养，接种后先在22-25℃左右条件下暗培养0-5d，然后置于光照10-12h，光照强度2000lx，温度为22-25℃左右的培养室中培养30-35d即可出瓶。5炼苗5.1生根苗移栽标准cm，基部长出3-5根不定根时，即可进行炼苗。5.2炼苗方法将培养瓶放置在有散射光的温室中，温度控制在（25±5）℃，松盖封口3-5d。6移栽6.1移栽时间为了提高成活率，建议生根瓶苗一般在春季和秋季炼苗移栽。6.2栽培基质及准备在保证组培穴盘苗正常生长的前提下，可因地制宜选择基质种类及配比，采用泥炭土：园土：珍珠岩＝5：3：2为最佳。将泥炭土、园土及珍珠岩按一定比例混配好，用800ppm多菌灵或百菌清喷透混匀，装入穴盘中并稍压紧待用。6.3洗苗轻轻取出组培苗，放入清水中，轻轻漂洗干净组培苗表面培养基，并用500ppm多菌灵或百菌清溶液浸泡20-30min，最后冲洗一次。6.4移栽用小拇指粗细的树枝将事先装好的穴盘基质捣个洞，之后将洗净的组培苗塞入其中，并稍压实。覆盖基质以刚盖过组培苗基部为宜，以幼苗不倒即可。6.5摆放穴盘苗分移栽日期，在苗床上整齐摆放。7温室苗期管理7.1栽后15d内管理栽后15天内要精心管护。温度一般控制在15-30℃；每天至少分5次给幼苗喷雾保湿，保持叶面湿度在75-90%；遮荫。7.215d后管理待15d缓苗期即长出新叶、新根后便可以进入正常小苗期管理了，大棚相对湿度保持在60-80%即可。7.3施肥移栽4至8周内，每隔7天可喷施高氮型叶面肥一次，稀释浓度为500-800ppm。8周后视植株生长情况，调整施肥浓度及施肥次数。8质量标准8.1组培苗质量标准8.1.1株形苗粗壮、挺直有活力，叶片大小协调、有层次感、色泽正常，叶色具原品种特性。8.1.2根系有不定根长出（一般3条以上），根长适中，色白健壮，根基处基本无愈伤。8.1.3苗高组培苗高度适中，一般3cm-8cm。8.1.4叶片数展开的叶片具4片以上。8.1.5整齐度同一批次90%以上的苗高度一致。8.1.6病虫害状况无污染及病虫害。8.2组培穴盘苗的质量标准8.2.1株形苗健壮、挺拔，株形饱满、完整，叶片大小协调，叶色具母本特性、有XX。8.2.2根系应具有完整而发达的根第，根系充满穴盘孔，能够易拔出而基质不变。8.2.3苗高穴盘苗矮壮墩实，一般10～15cm。8.2.4整齐度同一批次95%以上的苗高度一致。8.2.5纯度变异率低于5%。8.2.6病虫害状况穴盘苗无检疫性病虫害，无其他侵染性和非侵染性病害及虫害的危害症状。9包装、标签和运输9.1包装9.1.1组培苗产品应按照客户（或者订单）要求包装，同时保证组培苗成活率。9.1.2X脂苗包装：X脂苗仍保留在培养瓶中，培养瓶放在泡沫箱里，箱外再用纸箱包装，高温季节泡沫箱最好加冰袋。为防止上下倒置，运输时可使用托盘。9.1.3无X脂苗包装：生根组培苗洗去X脂后，先装入小塑料盒（袋），再放在泡沫箱里，箱外再用纸箱包装，高温季节泡沫箱里放冰块，运输时可不用托盘。9.1.4穴盘苗包装：穴盘装在小纸箱内，再将小纸箱装入大纸箱内，每箱装3-4个穴盘，运输时宜使用托盘。9.2标签每箱应贴上标签，注明品种、等级、规格、数量、产地、出苗日期、目的地、联系人、注意事项等。9.3运输装车时切勿倒置，用厢式货车运输以避免日晒、雨淋，运输途中温度保持10-25℃，应在5d内到达目的地。10档案管理执行林木种苗生产技术经营管理档案（LY/T2289）。

附录A（资料性附录）表A组培工厂设计、所需面积及设计要求组培工厂功能区面积，m2设计要求/说明年产50万株年产100万株年产200万株组培车间200370700需配置自动检测和喷淋的消防系统洗涤间152040通风、干燥;室内要有上、下水设施；地面防潮、防滑并便于清洗；内做大小水槽若干培养瓶晾干室52040通风、干燥，整洁，内置空调和通风装置试剂室（称量室）202020清洁、干燥、通风;终年保持相对较低温度;避免阳光直射；放置天平的台面要水平、稳固培养基配制室152040通风、干燥;配备大容量用电器专用线路;上下水道通畅培养基灭菌室52020地面与墙面必须能够耐受高湿状态;地面防滑，白瓷砖墙面;配备大容量用电器专用线路培养基储存室102040低温、干燥、整洁;避免光照；配置空调，通风装置、紫外灯等更衣室101020通风、干燥、整洁;紧连接种室;配置衣橱、鞋柜、洗手盆等接种室（无菌操作室）2050100控温（25±2）°C；控湿（相对湿度70%〜75%）；整洁、通风、光线好；内墙白色光滑;配置空调、超净工作台、紫外灯、移动臭氧发生器等培养室60150300控温（25±2）°C;控湿（相对湿度70%〜75%）；干净、整洁；内墙白色光滑;配制空调、通风装置、日光灯、培养架、独立控制紫外灯、自动定时设备等;设计时应考虑用电负荷，设置专线和配电设备出苗室202040控温、通风、光线好;内墙白色光滑;上下水道畅通贮存室202040通风、干燥;存储组培用的洗涤用品、放蒸倦水、酒精等物品母本圃50100100控温、控湿、控光、防虫、能釆用自然光组培苗驯化区5050100控温、控湿、可调控光装置、防虫组培苗移栽圃60012502700控温、控湿、控光、防虫、能釆用自然光辅助用房50100100包括控制间、物料间、包装间等办公室204080配置办公桌（椅）、电话、传真电话机、电脑、打印机、复印机、文件柜等办公设备其他生活空间204060包括休息室、洗手间等;休息室可加装饮水机、冰箱、微波炉、桌椅等

附录B（资料性附录）表B组培工厂所需主要设备及说明仪器设备名称年生产规模，万株规格型号用途说明50100200灭菌设备、器械立式高压灭菌锅（台）11150L，3.5kW；不锈钢内壁；自动控温、控压、定时；自动断电；最高工作压力0.165MPa；最高工作温度126°C培养基灭菌卧式高压蒸汽灭菌锅（台）012360L，不锈钢内壁，电加热;单门或双门，自动控温培养基灭菌电热干燥箱（台）111最高温度300°C;温度变化幅度±2°C玻璃器皿灭菌、干燥紫外灯（盏）若干若干若干30W/40W；接口类型与日光灯同房间消毒臭氧机（台）122220V，50Hz；160W〜180W亍灭菌时间可调；可移动房间消毒过滤灭菌器（只）若干若干若干过滤器滤膜孔径0.22 无菌封装；20mL塑料注射器及配套针头，无菌封装灭菌不能高温灭菌的试剂接种设备及器械超净工作台（台）4816双人或单人;水平或垂直送风；百级洁净度；接种，过滤灭菌等电热灭菌器（台）4816电加热；温度可调、可控，数字显示；最高温度350°C；温度变化幅度±10°C接种器械灭菌石英玻璃珠若干若干若干2mm〜2.5mm电热灭菌器导热、保温枪状镊（把）16326425cm，不锈钢材质接种用3#手术刀柄（把）12244812cm，不锈钢材质接种用10#手术刀片（包）若干若干若干圆头不锈钢刀片；10片/包接种用11#手术刀片（包）若干若干若干尖头不锈钢刀片；10片/包接种用手术剪（把）81632直剪；20cm不锈钢材质接种用接种器械搁置架（只）4816不锈钢材质搁置、冷却热的、已灭菌的接种器械接种盘（个）若干若干若干不锈钢材质盛装，切割植物材料培养设备和容器光照培养箱（个）122温度5°C〜50°C可调组培试验用组培用托盘（个）100020004000420minX490mmX4.5mm，可高温灭菌，镂空放置培养瓶空调（台）510201.5P-2.0P，壁挂式培养室温度控制培养架（组）60120240喷塑角135mm*50mm*1800mm，5层，层高300mm，每层2支36W荧光灯管放置培养瓶，植物培养晾瓶架（组）248喷塑角钢，135mmX50mmX1800mm，5层洗净培养瓶晾干培养瓶，万只3.5714250mL，内径6cm，高度9cm；耐高温玻璃或透光塑料材质，配套耐高温透光塑料盖组培用瓶

附录C（资料性附录）表C组培工厂所需玻璃器皿、器材及说明仪器设备名称年生产规模，万株规格用途说明50100200烧杯，套23350mL/100mL/250mL/500mL/1000mL/2000mL配母液、培养基用广口试剂瓶，套41010125mL/250mL/500mL/1000mL/2000mL存储母液用量筒，套22225mL/50mL/100mL/250mL/500mL/1000mL配培养基用容量瓶，套222100mL/250mL/500mL/1000mL/2000mL配母液用玻璃棒，根10202030cm配母液、培养基用棕色滴瓶，只222125mL配培养基用塑料洗瓶，只222500mL配母液、培养基用搪瓷杯，只5551000mL ，配培养基用铝盘，个255280mmX390mm配培养基用搪瓷盘，个255280mmX390mm配培养基用电饭煲，只11113L或以上配培养基用电水壶，只1115L或以上配培养基用塑料筐，个2510540mmX440mmX72mm组培室生产周转称量纸，包若干若干若干75mmX75mm；500张/包配母跃培养基用称量纸，包若干若干若干100mmX100mm；500张/包配母液及培养基用称量纸，包若干若干若干150mmX150mm；500张/包配母祕培养基用pH试纸，本若干若干若干pH5.4〜7.0配培养基用定性滤纸，盒若干若干若干90mm，中速，100张/包外植体接种用试管刷，支若干若干若干各式规格洗瓶用塑料大盆，只244洗瓶用三防袖套，副若干若干若干防水、防静电、防菌洗瓶用乳胶手套，副若干若干若干洗瓶用棉布，米若干若干若干包接种盘用工作服，件81632大号/中号/小号接种用接种三防工作服，件81632防水、防静电、防菌;分体式，全套三件接种用实验帽，顶81632接种用一次性手套，副若干若干若干PE塑料薄膜手套接种用一次性口罩，只若干若干若干接种用一次性鞋套，副若干若干若干临时人员出入用脱脂纱布，包若干若干若干医用敷料级接种人员用医用脱脂棉，包若干若干若干接种人员用凉拖鞋，双61220各种尺码接种人员用棉拖鞋，双61220各种尺码接种人员用垃圾箱，只101525接种人员用垃圾袋，捆若干若干若干接种人员用

表C组培工厂所需玻璃器皿、器材及说明（续）仪器设备名称年生产规模，万株规格用途说明50100200垃圾袋，捆若干若干若干接种人员用记录本，本若干若干若干记录用中性笔，支若干若干若干记录用打码机，只61018编码打码用标签纸，卷若干若干若干编码打码用定时器，只若干若干若干记录时间

附录D（资料性附录）表D.植物组培常用化学试剂、药品药品中文名称分子式分子量级别保存方法无机盐类——大量元素硝酸铵NH4NO380.05AR室温、干燥、避直射光、通风良好硝酸钾KNO3101.11AR室温、干燥、避直射光、通风良好二水合氯化钙CaCl2・2H2O147.02AR室温、干燥、避直射光、通风良好无水氯化钙CaCl2111.02AR室温、干燥、避直射光、通风良好七水合硫酸镁MgSO4・7H2O246.47AR室温、干燥、避直射光、通风良好磷酸二氢钾kh2po4136.09AR室温、干燥、避直射光、通风良好硫酸铵（nh4）2so4132.13AR室温、干燥、避直射光、通风良好一水合磷酸二氢钠NaH2PO4•H2O138.00AR室温、干燥、避直射光、通风良好磷酸二氢钠NaH2PO4120.05AR室温、干燥、避直射光、通风良好四水合硝酸钙Ca（NO3）2•4H2O236.15AR室温、干燥、避直射光、通风良好七水合硝酸钙Ca（NO3）2•7H2O290.20AR室温、干燥、避直射光、通风良好氯化钾KC174.55AR室温、干燥、避直射光、通风良好硫酸钠Na2SO4142.04AR室温、干燥、避直射光、通风良好无机盐类——微量元素四水合硫酸锰MnSO4•4H2O223.01AR室温、干燥、避直射光、通风良好一水合硫酸锰MnSO4•H2O169.02AR室温、干燥、避直射光、通风良好七水合硫酸锌ZnSO4•7H2O287.55AR室温、干燥、避直射光、通风良好硼酸H3BO361.83AR室温、干燥、避直射光、通风良好碘化钾KI166.01AR室温、干燥、避光、通风良好二水合钥酸钠Na2MoO4•2H2O241.95AR室温、干燥、避直射光、通风良好五水合硫酸铜CuSO4-5H2O249.68AR室温、干燥、避直射光、通风良好六水合氯化钻CoC12-6H2O237.93AR室温、干燥、避直射光、通风良好表D（续）药品中文名称分子式分子量级别保存方法无机盐类——铁盐七水合硫酸亚铁FeSO4-7H2O278.03AR室温、干燥、避直射光、通风良好硫酸铁Fe2（SO4）3399.88AR室温、干燥、避直射光、通风良好乙二胺四乙酸二钠C10H14N2O8Na2•2H2O372.25AR室温、干燥、避直射光、通风良好有机物甘氨酸75.07BR99.5%室温、干燥、避直射光、通风良好盐酸硫氨素337.27BR99.6%室温、干燥、避直射光、通风良好盐酸吡哆醇205.64BR99.7%室温、干燥、避直射光、通风良好烟酸123.11BR99.8%室温、干燥、避直射光、通风良好肌醇180.16BR99.9%室温、干燥、避直射光、通风良好水解酪蛋白BR冷藏（4°C），避光水解乳蛋白BR冷藏（4°C），避光蔗糖342.30AR室温、干燥、避直射光、通风良好葡萄糖180.00AR室温、干燥、避直射光、通风良好X脂凝结强度1200g•cm2〜1300g•cm2室温、干燥、避直射光、通风良好植物生长调节剂6-苯基嘌呤225.25BR室温、干燥、避直射光、通风良好6-糖氨基嘌呤215.21BR室温、干燥、避直射光、通风良好玉米素219.24BR99%冷冻（-20°C），避光噻苯隆220.32BR99%冷藏（4°C），避光6-异戊烯基腺嘌呤203.24BR冷藏（4°C），避光a-苯乙酸186.21BR室温、干燥、避直射光、通风良好吲哚乙酸175.19BR室温、干燥、避直射光、通风良好

表D（续）药品中文名称分子式分子量级别保存方法吲哚丁酸203.23BR室温、干燥、避直射光、通风良好2，4-二氯苯氧乙酸221.04BR室温、干燥、避直射光、通风良好腺嘌呤135.13BR室温、干燥、避直射光、通风良好赤霉素346.38BR冷藏（4°C），避光乙烯利144.50BR室温、干燥、避直射光、通风良好脱落酸264.32BR冷冻-20°C），避光消毒剂甲醛30.03AR室温、干燥、避直射光、通风良好高锭酸钾158.03AR室温、干燥、避直射光、通风良好乙醇46.07CP95%室温、干燥、避直射光、通风良好新洁尔灭溶液384.445%室温、干燥、避光、通风良好次氯酸钠溶液74.44AR5.2%室温、干燥、避直射光、通风良好氯化汞271.5AR室温、干燥、避光、通风良好吐温-20CP冷藏（4°C），避光洗涤剂洗衣粉中性室温、干燥、避直射光、通风良好洗洁精中性室温、干燥、避直射光、通风良好其他活性炭12AR粉室温、干燥、避直射光、通风良好盐酸HC136.46AR低温、干燥、避直射光、通风良好氢氧化钠NaOH40.01AR室温、干燥、避直射光、通风良好

附录E（资料性附录）组培快繁规模化生产

附录F（资料性附录）

表FMS基本培养基母液配制母液种类试剂名称标准重量，mg/L扩大倍数称取重量，mg/L保存方式大量元素硝酸钾19002038000冷藏（4°C）避光保存硝酸铵165033000磷酸二氢钾17034