热点专题09基因工程中限制酶的选择-2023年高考生物临考热点梳理解读精讲课件

高考热点专题专题《基因工程中限制酶的选择》人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。（1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是

，在R末端添加的序列所对应的限制酶是

。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要

种酶。考点：启动子的方向限制酶的选择2021年山东卷25题SalIEcoRI6（2）将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是

。

（3）向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于

，理由是

。启动子的调控F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上根据有无荧光情况判断，F1～F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游（右侧）；F5～F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游（左侧），所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上考点：磷酸二酯键5ˊ

3ˊ

ˊ5ˊ4一、限制酶作用的化学键在哪里？3’二、限制酶的识别序列有什么特点？下图体现了限制酶的什么特点？具有特异性（专一性）。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成；限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线(如图)，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复、互补排列的。不同的酶切不同的识别序列切出相同的末端；

不同的酶切相同的识别序列切出不同的末端；一种酶的识别序列中包含另一种酶的识别序列。几种特殊情况需注意三、限制酶的作用结果是？7产生平末端产生黏性末端四、限制酶的选择原则(1)首先要确保目的基因和质粒上有所选酶的切点；其次应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图C可选择EcoRⅠ或BamHⅠ和HindⅢ，应选择切点位于启动子、终止子之间的酶。如图b

中EcoRⅠ和Sau3AⅠ。(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，也不可以选择切点位于质粒中启动子、终止子、标记基因、复制原点内部的限制酶，如图C不能选择SmaⅠ。(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图C也可选择用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。（4）还要注意转录方向。如图C不能选择EcoRⅠ和HindⅢ。①单酶切和双酶分别切割法（用两种能产生相同末端的限制酶切割）缺点:质粒重新环化目的基因自身环化质粒与目的基因反向连接五、比较单酶切和双酶切②双酶切（用两种能产生不同末端的限制酶切割）防止质粒重新环化防止质粒与目的基因反向连接防止目的基因自身环化优点:例1.研究者欲将某改良基因导入大肠杆菌的质粒中保存，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，结构如图乙。为实现质粒和改良基因的高效连接，选用限制酶XmaI而不选用限制酶SmaⅠ的原因是________________________________________________________。为将改良基因构建在质粒上，还需要______________________等酶。（2022淄博一模节选）Smal的酶切末端为平末端，无法与改良基因上的黏性末端连接

BglⅡ、DNA连接酶【典型例题】例2.要在乳酸杆菌中表达W基因，需使用图1中的质粒为载体。图2为克隆得到的含W基因的DNA片段，W基因以乙链为转录模板链。①启动子往往具有物种特异性，在图1质粒中插入W基因，其上游启动子应选择_______（填字母）。A．枯草芽孢杆菌启动子

B．乳酸杆菌启动子

C．农杆菌启动子②下表是几种限制酶的识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点。限制酶EcoRIBamHIKpnIMfeIHindⅢ识别序列及切割位点

为获得能正确表达W基因的重组质粒，应选用限制酶____________切割图1中的质粒，选用限制酶____________切割图2中含W基因的DNA片段。BMfeI、HindⅢEcoRI、HindⅢ例3.现需要构建同时含有mLDH、FDH的基因表达载体。请你根据下图，提出将两个基因依次连入载体的思路___________（要体现选用的内切酶和连接的先后顺序）。先用NdeI和XhoI酶切质粒2和空载体，将两种酶切产物连接获得连接产物。用NcoI和MseI酶切质粒1，用Ncol和Ndel酶上一步中的连接产物，将两种酶切产物连接获得基因表达载体1.在DNA测序工作中，需要将某些限制酶的限制位点在DNA上定位，使其成为DNA分子中的物理参照点，这项工作称为“限制酶图谱的构建”。现用限制酶HindⅢ、BamHI以及二者的混合物分别降解一个4kb（1kb即1千个碱基对）大小的线性DNA分子，然后通过某种方法将获得的不同长度的DNA片段分开，结果如下图所示：

据此分析，这两种限制酶在该DNA分子上的限制位点数目是以下哪一组（）

A．HindⅢl个，BamHI2个B．HindⅢ2个，BamHI3个

C．HindⅢ2个，BamHI1个D．HindⅢ和BamHI各有2个2.图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspI、BamHI、MboI、SmaI4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题

（1）图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由

连接。

（2）若用限制酶SmaI完全切割图1中DNA片段，产生的末端是

末端，其产物长度为

。

（3）若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaI完全切割，产物中共有

种不同长度的DNA片段。

（4）若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是

。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加

的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是

。3.如表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：（1）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用___________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过________酶作用后获得重组质粒．为了扩增重组质粒，需将其转入处于_______的大肠杆菌。若用Sau3AⅠ