蛋白质纯化技术Lite

分子生物学圣经—分子克隆实验指南当前第1页\共有81页\编于星期六\11点为什么要纯化蛋白质？理论意义：深入研究某种蛋白质的功能以及作用机制，如信号通路中的蛋白质…应用价值蛋白质工程医药、工业、科研…作为药物靶点…蛋白质是生命功能的执行者当前第2页\共有81页\编于星期六\11点蛋白质工程中进行蛋白质纯化的必要性首先，需要单一的蛋白质作为实验材料，研究其结构与功能；其次，对蛋白质进行修饰改造时需要单一的蛋白质作为原材料；最后，为了生产性能更优良的蛋白质，需要对设计改造过的蛋白质进行大量纯化，从而开发出相关产品。当前第3页\共有81页\编于星期六\11点本章概要蛋白质纯化方法蛋白质纯化原则纯化步骤蛋白质的鉴定当前第4页\共有81页\编于星期六\11点一、蛋白纯化方法蛋白质纯化的根据：

不同的蛋白质，理化性质不同。理化性质不同的原因：氨基酸的数目和序列不同。当前第5页\共有81页\编于星期六\11点1.与蛋白质分离纯化相关的理化特性①分子大小②分子形状③带电特性④溶解特性⑤与配体特异性结合不同⑥吸附性质⑦变性和复性当前第6页\共有81页\编于星期六\11点1.1分子大小蛋白质分子大小主要取决于：

蛋白质肽链的数目每条肽链的氨基酸残基数目。几百~百万Da常用方法透析超滤凝胶过滤离心当前第7页\共有81页\编于星期六\11点

透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。当前第8页\共有81页\编于星期六\11点当前第9页\共有81页\编于星期六\11点

超滤法

应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。当前第10页\共有81页\编于星期六\11点

超滤法

应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。当前第11页\共有81页\编于星期六\11点凝胶过滤是按照天然蛋白质相对分子质量大小进行分离的技术，又称为分子筛层析或排阻层析。当前第12页\共有81页\编于星期六\11点当前第13页\共有81页\编于星期六\11点超速离心离心（centrifugation）：利用机械的快速旋转所产生的离心力，将不同密度的物质分离开来的方法。超速离心法(ultracentrifugation)：~60万g，6万~8万r/min。可用来测定蛋白质分子量。当前第14页\共有81页\编于星期六\11点超速离心当前第15页\共有81页\编于星期六\11点1.2分子形状形状蛋白质在离心通过溶液时，或通过膜、凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中时，都会受到分子形状的影响。方法梯度离心电泳当前第16页\共有81页\编于星期六\11点1.3电荷原理蛋白质的净电荷与蛋白质等电点pI以及环境pH值有关（pH>pI，－）方法电泳离子交换层析当前第17页\共有81页\编于星期六\11点当前第18页\共有81页\编于星期六\11点1.4溶解度原理蛋白质分子表面亲水性和疏水性带电基团不同，因此在溶剂中的溶解度不同。通过改变pH、离子强度或加入有机试剂，促进蛋白质分子的凝聚进而形成沉淀。方法：沉淀法盐析法（eg.硫酸铵）有机溶剂沉淀法（eg.丙酮）等电点沉淀法当前第19页\共有81页\编于星期六\11点蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出，称为盐析。盐析原理：高浓度盐离子破坏蛋白质分子表面的水化膜，影响蛋白质分子表面所带电荷，从而引起蛋白质沉淀，但通常不会引起蛋白质的变性。盐析法当前第20页\共有81页\编于星期六\11点1.5配体特异性结合原理生物大分子的某些特定结构区域能够特异性识别其他分子并可逆结合，生物分子间的这种结合能力称为亲和力。方法将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性对另一个分子进行分离纯化。分类免疫亲和层析生物亲和层析金属螯合亲和层析当前第21页\共有81页\编于星期六\11点1.6吸附性质原理

蛋白质可吸附在不同材料的表面，如金属、陶瓷、塑料等。方法疏水层析当前第22页\共有81页\编于星期六\11点1.7变性和复性原理变性：蛋白质在一定的理化条件下会失去原有的空间结构、生物学功能及部分理化特性。复性：当变性条件去除后恢复原有的空间结构及生物学功能。方法如，利用尿素的变性和复性方法，从包涵体中纯化原核表达蛋白当前第23页\共有81页\编于星期六\11点2.分离方法在实验操作上，分为：沉淀法离心法电泳法超滤法相分配法层析法当前第24页\共有81页\编于星期六\11点当前第25页\共有81页\编于星期六\11点*不可能有一套统一的方法适用于分离纯化所有的蛋白质，*但每一种蛋白质可能都有一套适合的分离纯化程序，*而且所用的主要技术手段都基本相同。Note当前第26页\共有81页\编于星期六\11点二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤总原则以合理的效率、速度、收率和纯度，将目标蛋白从细胞的全部其他成分，特别是从杂蛋白中分离出来，同时仍保留其生物学活性和化学完整性。当前第27页\共有81页\编于星期六\11点二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤步骤选择实验材料，实验材料预处理蛋白质的提取蛋白质的粗分级蛋白质的细分级蛋白质的鉴定当前第28页\共有81页\编于星期六\11点蛋白质纯化的前期准备关于蛋白质我们已知什么？最好的来源？蛋白质纯度要求？活性要求？纯化蛋白的量？如何进行鉴定？纯化时间长短？最终花费？纯化方案？当前第29页\共有81页\编于星期六\11点1、选择实验材料及预处理选择实验材料物种的选择组织的选择实验材料预处理液体材料过滤离心固体材料洗涤：自来水—蒸馏水—提取缓冲液材料破碎：当前第30页\共有81页\编于星期六\11点材料破碎机械剪碎研磨反复冻融法超声破碎法高压匀浆法酶解法当前第31页\共有81页\编于星期六\11点2、蛋白质的提取①提取分离原则尽可能多地提取目的蛋白，同时避免活性丢失（温度过高、pH、有机试剂、金属离子、蛋白酶等因素）选择合适的pH、选择合适的离子强度当前第32页\共有81页\编于星期六\11点2、蛋白质的提取②提取液成分的确定pH缓冲液：Tris-HCl,Tris-Gly,Gly-HCl,柠檬酸-柠檬酸钠…离子：动物NaCl,植物KCl还原剂:DTT…蛋白酶抑制剂：EDTA,PMSF…金属离子螯合剂:EDTA,EGTA…去污剂:SDS,CHAPS,TritonX-100,Tween-20甘油③温度0~4℃当前第33页\共有81页\编于星期六\11点3、蛋白质的粗分级（粗提）使用蛋白质提取缓冲液提取实验材料后，蛋白提取液中目标蛋白质的浓度往往较低，采取一些简单的方法使目标蛋白质浓缩，同时去除大量的杂质。常用的实验技术：沉淀法（盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀）、超速离心、透析、超滤…当前第34页\共有81页\编于星期六\11点4、蛋白质的细分级粗分级只是使蛋白质得到浓缩和初步分离纯化，多数情况下还要根据蛋白质分子大小、分子形状、分子表面特征或分子带电状况进一步纯化。常用的实验技术：层析当前第35页\共有81页\编于星期六\11点4.1.层析（chromatography）固定相：凝胶流动相：缓冲液原理：当前第36页\共有81页\编于星期六\11点凝胶介质PharmaciaBioGelAagaroseBioGelPacrylamideBio-RadSephadexglucose(dextrose)SepharoseagaroseSephacrylglucose+acrylamideSephacelcellulose当前第37页\共有81页\编于星期六\11点

层析装置（Chromatographicequipment）蠕动泵层析柱检测器记录仪部分收集器当前第38页\共有81页\编于星期六\11点①②③当前第39页\共有81页\编于星期六\11点当前第40页\共有81页\编于星期六\11点4.1.层析（chromatography）分子筛层析（Gelfiltration）离子交换层析（Ionexchange）疏水作用层析（Hydrophobicinteraction）亲和层析（Affinity）当前第41页\共有81页\编于星期六\11点4.1.1分子筛层析（Gelfiltration）原理也称为凝胶过滤、排阻层析。是以多孔凝胶材料为支持物，当蛋白质溶液流经此支持物时，分子大小不同的蛋白质所受到的阻滞作用不同而先后流出，从而达到分离纯化的目的。凝胶介质葡聚糖（glucose）琼脂糖（agarose）聚丙烯酰胺（acrylamide）纤维素（cellulose）当前第42页\共有81页\编于星期六\11点分子筛层析

GelfiltrationchromatographyHydrophilicNospontaneousbindingtoproteins.ChemicallyandphysicallystableRigidtoallowahighlinearflow-rate亲水对蛋白质亲和力低物理化学性质稳定流速稳定当前第43页\共有81页\编于星期六\11点分子筛层析

Gelfiltrationchromatography当前第44页\共有81页\编于星期六\11点分子筛层析

Gelfiltrationchromatography>>当前第45页\共有81页\编于星期六\11点分子筛层析

Gelfiltrationchromatography>>当前第46页\共有81页\编于星期六\11点4.1.2离子交换层析（Ionexchange）原理在一定的pH条件下，不同的蛋白质带有的电荷的种类和数量不同，因此它们与带电的凝胶颗粒间的电荷相互作用不同。利用蛋白质和带电凝胶之间作用力的差别，把蛋白质分开的层析方法。当前第47页\共有81页\编于星期六\11点4.1.2离子交换层析（Ionexchange）种类阳离子交换柱：凝胶带负电荷，蛋白质带正电荷阴离子交换柱：凝胶带正电荷，蛋白质带负电荷介质惰性支持物：琼脂糖，葡聚糖…带电基团：羧甲基—带负电；二乙基氨基—带正电平衡离子：负电基团：H+或Na+

正电基团：OH-或Cl-当前第48页\共有81页\编于星期六\11点离子交换层析（Ionexchange）阳离子交换：阴离子先，阳离子后阴离子交换：阳离子先，阴离子后当前第49页\共有81页\编于星期六\11点4.1.3亲和层析（Affinitychromatography）原理利用蛋白质与配体专一性识别并结合的特性而分离蛋白质的一种层析方法。将配体固定于支持物上，当混合样品流过此支持物时，只有目标蛋白能与配体专一性结合。先用缓冲液洗脱杂蛋白，然后改变洗脱条件，将目标蛋白洗脱下来。当前第50页\共有81页\编于星期六\11点亲和层析（Affinitychromatography）当前第51页\共有81页\编于星期六\11点His-亲合示意图（金属螯合层析）固相载体镍柱（Ni-NTA）PETexpressionsystem当前第52页\共有81页\编于星期六\11点4.1.4疏水作用层析原理蛋白质表面疏水基团与介质疏水配体的可逆相互作用方法高离子强度下待分离的样品吸附在疏水介质上，然后降低离子强度选择性将样品解吸，疏水弱的物质先洗脱，疏水强的物质后洗脱。当前第53页\共有81页\编于星期六\11点4.2.电泳（Electrophoresis

）电泳就是带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动。当前第54页\共有81页\编于星期六\11点蛋白质常用电泳技术聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）等电聚焦电泳（Isoelectricfocusing-IEF）双向电泳（TwoDimensionalElectrophoresis

）当前第55页\共有81页\编于星期六\11点4.2.1SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS：1、覆盖蛋白质表面电荷，消除电荷差异2、改变蛋白质分子构象，消除形状差异当前第56页\共有81页\编于星期六\11点电泳法测目标蛋白的分子量当前第57页\共有81页\编于星期六\11点不连续PAGE分离蛋白质的原理在不连续电泳系统中，所带电荷、分子大小和形状不同的蛋白质在凝胶中能够被分离。原理电荷效应浓缩效应快慢离子效应凝胶浓度差效应分子筛效应当前第58页\共有81页\编于星期六\11点4.2.3等电聚焦电泳（Isoelectricfocusing—IEF）当前第59页\共有81页\编于星期六\11点等电聚焦（Isoelectricfocusing）当前第60页\共有81页\编于星期六\11点4.2.4双向电泳第一向：等电聚焦（pI）第二向：SDS(MW)双向电泳技术是蛋白质组学研究中蛋白质多肽链分离纯化和鉴定的主要实验技术之一。当前第61页\共有81页\编于星期六\11点①Isoelectricfocusing②SDSgelelectrophoresis当前第62页\共有81页\编于星期六\11点TwoDimensionalElectrophoresisofE.coliProteins

-morethan2,000proteinswerevisualized当前第63页\共有81页\编于星期六\11点蛋白质纯化策略方案设计篇

Proteinpurificationstrategy当前第64页\共有81页\编于星期六\11点三、纯化方案设计原则确定纯化目标purity,activityandquantity充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性tosimplifytechniqueselectionandoptimisation确定活性测定方法fastdetectionofproteinactivity/recoveryandcriticalcontaminants尽量减少纯化步骤extrastepsreduceyieldandincreasetime,combinestepslogically当前第65页\共有81页\编于星期六\11点确定纯化目标当前第66页\共有81页\编于星期六\11点三、纯化方案设计原则确定目标purity,activityandquantity充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性tosimplifytechniqueselectionandoptimisation确定活性测定方法fastdetectionofproteinactivity/recoveryandcriticalcontaminants尽量减少纯化步骤extrastepsreduceyieldandincreasetime,combinestepslogically当前第67页\共有81页\编于星期六\11点三、纯化方案设计原则确定目标purity,activityandquantity充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性tosimplifytechniqueselectionandoptimisation确定活性测定方法fastdetectionofproteinactivity/recoveryandcriticalcontaminants尽量减少纯化步骤extrastepsreduceyieldandincreasetime,combinestepslogically当前第68页\共有81页\编于星期六\11点严格依据目标蛋白质的特殊生物学性质，来设计活性检测方案常见检测方法:酶学检测enzymaticassays.配体检测ligand-bindingassays免疫检测immunologicalassays活性测定方法的要求：快速、简便、特异和定量确定活性检测方法当前第69页\共有81页\编于星期六\11点三、纯化方案设计原则确定目标purity,activityandquantity充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性tosimplifytechniqueselectionandoptimisation确定活性测定方法fastdetectionofproteinactivity/recoveryandcriticalcontaminants尽量减少纯化步骤extrastepsreduceyieldandincreasetime,combinestepslogically当前第70页\共有81页\编于星期六\11点尽量减少纯化步骤纯化步骤越多，样品损失越大（产量、活性）当前第71页\共有81页\编于星期六\11点减少每步操作时间toavoidlengthyprocedureswhichrisklosingactivity/reducingrecovery减少添加物additivesmayneedtoberemovedinanextrapurificationstepormayinterferewithactivityassays早期除去降解物（如蛋白酶）forexample,proteases每步使用不同的纯化方法totakeadvantageofsamplecharacteristicswhichcanbeusedforseparatio