高中生物-BCA法测定蛋白质浓度课件

测定蛋白质浓度BCA法学习掌握BCA法测定蛋白质浓度的基本原理。【实验目的】【实验原理】

BCA(bicinchoninicacid，二辛可酸)法测定蛋白质的原理与Lowery法相似，即在碱性条件下蛋白质与二价铜离子Cu2+络合，并将其还原成一价铜离子Cu1+。一价铜离子和BCA试剂反应,使其由原来的苹果绿形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm有强烈的光吸收，且吸光值和蛋白质浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此可用于蛋白质浓度测定。BCA测定蛋白质的范围是20μg/ml~200μg/ml，微量BCA测定范围在0.5μg/ml~10μg/ml。Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度

蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。【实验器材与试剂】

1．器材（1）仪器：分光光度计；恒温水浴箱；枪式移液管。（2）玻璃仪器：试管13支，吸管2ml1支、O.1ml3支。2．试剂（1）试剂A：1％BCA二钠盐2％无水碳酸钠0.16%酒石酸钠0.4％氢氧化钠0.95％碳酸氢钠混合，调pH值至11.25。（2）试剂B：40g/L硫酸铜。（3）BCA工作液：试剂A100ml＋试剂B2ml，混合即成。市面有BCA法试剂盒销售

4）蛋白质标准液：用结晶牛血清白蛋白，根据其纯度用生理盐水配制成1.5mg/ml的蛋白质标准液。（5）待测样品。【实验步骤】1．取试管13支，编号（除空白管只做1管外，其它各号测定管均重复做两管），按下表操作并记录：

BCA法测定蛋白质含量管号试剂(μl)空白管标准管测定管×21×22×23×24×25×2蛋白质标准液(1.5mg/ml)—20406080100—双蒸水10080604020——待测样品——————100BCA工作液(ml)2.02.02.02.02.02.02.0混匀，37℃保温30min，比色测定光吸收值(λ=562nm)2．以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。3．用测定管平均光吸收值在标准曲线上查出相应的蛋白质含量，计算求出该待测血清蛋白质的含量(g/L)。4．从标准管中选择一管与测定管光吸收值相接近者，按比色法计算公式计算求出该待测血清的蛋白质浓度(g/L)。【思考题】试比较BCA法与双缩脲法、Lowery法的异同。为什么BCA法常常用于科研？其有哪些优势？【实验原理】分子中含有两个或两个以上肽键(-CONH-)的化合物，在碱性溶液中能与硫酸铜中Cu2+反应生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多肽键，具有双缩脲反应，且在一定范围内紫红色颜色的深浅与蛋白质含量成正比，因此可以用光吸收法测定样品中蛋白质的含量。双缩脲法测定血清蛋白质含量此方法被科研工作者广泛选用，其特点：1.操作简便，快速，比经典的Lowry法快4倍；2.灵敏度高，最小检测量达0.5μg；3.准确，试剂稳定性好，在20μg/ml~2000μg/ml浓度范围内有良好的线性关系，检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法；4.经济实用，测定可在微板孔中进行（待测样品体积为1μl-20μl），可大大节约样品和试剂用量；5.抗干扰能力较强，不受绝大部分样品中的去污剂、尿素等化学物质影响。方法基本原理灵敏度（mg/ml）干扰程度和主要干扰物蛋白质种类造成误差快速性复杂性凯氏定氮法(Kjedahl法)将蛋白质蒸馏转化为氨,再用酸吸收后滴定,计算其含量0.2~1.0低，非蛋白蛋小慢复杂双缩脲法(Biuret法)多肽链与碱性酮离子生成紫红色复合物1~20中等，硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸小快速简易Folin-酚试剂法(Lowry法)磷钼酸-磷钨酸被酪氨酸和苯丙氨酸还原生成蓝色复合物0.001~0.005严重,硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇大较复杂紫外分光光度法(UV法)蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基在280nm有光吸收0.01~0.1较严重，各种嘌呤、嘧啶、核苷酸大快速简单考马斯亮蓝法（Bradford）蛋白质与考马斯亮蓝结合最大光吸收465nm变为595nm0.001~0.005低，强碱性缓冲液；TritonX-100；SDS大