酶工程考试重点

酶：是由活细胞产生的，具有高效、专一催化功能的生物大分子。分为蛋白类酶（P酶）和核酸类酶（R酶）酶工程：是生物技术的重要分支，它是酶学和微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的交叉科学技术，他是从应用的目的出发，研究酶的生产与应用的一门技术性科学。可分为化学酶工程和生物酶工程。化学酶工程主要指天然酶、化学修饰酶、固定化酶及化学人工酶的研究与应用；生物酶工程是酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物，主要包括①用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）②修改酶基因产生遗传修饰酶（突变酶）③设计新的酶基因，合成自然界不曾有的新酶。酶工程的主要任务是经过预先设计，通过人为操作，获得人们所需要的酶，并通过各种方法使酶充分发挥其催化功能。食品酶工程是将酶工程的理论与技术应用于食品工业领域，将酶学基本原理与食品工程相结合，为新型食品及食品原料的发展提供技术支持。锁钥学说：当底物契合到酶蛋白的活性中心时，很像一把钥匙插入到一把锁中，因而使底物发生催化反应。 中间产物学说：第五必须首先与酶形成中间复合物，然后再转变为产物，并重新释放出游离的酶。 诱导契合学说：酶分子的构象与底物原来并非恰当吻合，只有当底物分子与酶分子相碰撞时，可诱导酶蛋白的构象变得能与底物配合，才结合形成中间络合物，进而引起第五份子发生相应的化学变化。核酸类酶：具有催化活性的RNA酶催化作用的特点：①酶的温和性②专一性③高效性④可调性机理：降低反应活化能。酶活性的调节：《1》酶的可逆共价调节：指酶蛋白分子上的某些残基在另一种酶的催化下进行可逆的共价修饰，从而使酶在活性形式与非活性形式之间相互转变的过程；《2》酶的别构调节：指某些化合物（成为配给或效应物）与酶的活性中心以外的位点结合后，引起酶蛋白构象的变化，从而改变酶活性的方式，能发生别构效应的酶称为别构酶。别构酶有多亚基，两中心（活性中心（负责对底物的结合与催化）、别构中心（可结合效应物，负责调解酶促反应的速率））协同效应：指蛋白质和一个配体（包括底物和效应物）结合之后，可以影响蛋白质和另一个配体之间的结合能力。同工酶：指能催化相同的化学反应，但蛋白质分子结构不同的一组酶。没作用的高效性机制：①邻位效应及定位效应②底物分子形变③酸碱催化④共价催化⑤金属离子催化⑥活性部位微环境的影响⑦协同催化双底物酶促反应动力学：（一）顺序机制：主要特征：酶结合底物和释放产物是按一定顺序进行。①有序顺序机制（底物与酶的结合以及产物的释放有严格的顺序）②随机顺序机制（两个底物与酶的结合顺序是随机的）（二）乒乓反应机制：反应过程中底物与产物是交替的与酶结合。※属于乒乓机制的酶大多是具有辅酶的。PH影响酶促反应速率的原因：①影响酶分子的构象②影响酶和底物的解离③影响酶活性中心基因解离④影响中间复合物的解离抑制剂对酶促反应的影响：（一） 不可逆的抑制作用①专一性不可逆抑制：KS型、Kcat型②非专一性不可逆抑制（二） 可逆的抑制作用①竞争性抑制作用（抑制剂通常与底物结构类似，与底物竞争酶的结合部位，并与酶形成可逆的复合物）抑制程度取决于底物和抑制剂的相对浓度，且这种抑制作用可以通过提高底物浓度的方法来解除※特点：Vm不变Kmf②非竞争性抑制作用：底物，抑制剂与酶的结合互不相干，二者可独立地与酶结合※特点：Km不变Vm；③反竞争性抑制作用：抑制剂必须在酶与底物结合后才能与之结合※特点：Km；Vm；酶的比活力（比活性）：指每克酶蛋白所含的酶活力单位数对同一种酶来说，酶的比活力越高，纯度越高。别构酶：又称变构酶，多为较复杂的寡聚糖，含有两个或多个亚基修饰酶：某些酶蛋白肽链上的侧链基团在另一酶的催化下可与某些化学基团发生共价结合或解离，从而改变酶的活性，这一调节酶活性的方式称为酶的共价修饰调节，酶称为~~结构酶：也称组成酶，是细胞内天然存在的酶，以恒定速率和恒定数量生成，含量较为未定，受外界影响很小。诱导酶：指当细胞中加入特定诱导物后，诱导产生的酶，其含量在诱导物存在下显著提高，这种诱导物往往是该酶底物的类似物或底物本身。现代发酵技术：①分批发酵②补料--分批发酵③半连续发酵④连续发酵⑤高细胞密度培养提高酶发酵产量的方法：.《1》酶的合成调控机制：（一）酶生物合成的诱导（能够诱导某些酶合成的化合物称为酶的诱导剂，诱导剂的使用可以显著提高酶产量，分三类：①酶的作用底物②酶的底物类似物酶的反应产物）（二）酶生物合成的阻碍（为避免分解代谢阻碍①采用难以利用的碳源②采用分次添加碳源的培养方法③添加一定量的CAMP）可通过控制末端产物浓度接触阻碍《2》控制发酵条件提高酶产量《3》通过基因突变〜〜《4》通过基因重组〜〜《5》添加表面活性剂，添加产酶促进剂，添加诱导物，控制阻碍物※酶生物合成的模式：①同步合成型②延续合成型③中期合成型④滞后合成型首选是②延续合成型。为提高产酶率和缩短发酵周期，它属于延续合成型的酶，在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别）酶分离纯化的一般原则：①减少或防止酶的变性失活②酶的提取③酶的纯度与保存酶的纯化（盐析法，等点沉淀法，有机溶剂沉淀法，共沉淀法，双水相萃取法，反胶团萃取法，凝胶层析法，透析法）酶的分离纯化三个基本环节：①抽提（把酶从原料中抽提出来，并尽可能的减少杂质引入，得到粗酶溶液）②纯化（把杂质从酶溶液中除掉或把酶从酶溶液中分离出来）③制剂（把分离纯化后的酶制备成各种不同的剂型）细胞破碎分机械破碎法和非机械破碎法两大类:①渗透压法②酶溶法③化学法④匀浆法研磨法⑥冻融法⑦超声波破碎法⑧压榨法提取影响因素：①目的酶在提取溶剂中溶解度的大小②酶由固相扩散到液相的难易程度③溶剂的PH④提取时间⑤温度（一般0-5°C；）⑥搅拌与氧化浓缩方法有①蒸发浓缩法②超滤浓缩法③冷冻浓缩法④凝胶过滤浓缩法⑤沉淀法⑥透析法⑦吸收浓缩法纯化方法有①盐析法②等点沉淀法③有机溶剂沉淀法④共沉淀法⑤双水相萃取法⑥反胶团萃取法⑦凝胶层析法⑧透析法结晶主要影响因素：①酶的纯度（50%以上）②酶蛋白的浓度③晶种④温度⑤合适的饱和度⑥PH⑦金属离子⑧搅拌⑨重结晶⑩其他 主要方法：①盐析法②有机溶剂法③微量蒸发扩散法④透析平衡法⑤等电点法酶纯度方法评析标准：一是酶活回收率；二是比活力提高的倍数；三是方法的重现性纯化操作每一步都不可避免的造成活性损失，原因有二：一是由于部分酶变性失活；二是由于各种纯化方法的分辨率有限，部分酶可能连同杂蛋白一起被除去。酶活回收率是纯化后样品的总酶活占纯化前样品的总酶活的百分比，它反映了纯化过程中酶活力的损失情况，这一比值越高说明酶活的保存率越高，酶活的损失越少。比活力的提高倍数则反映了纯化方法的效率。纯化后比活力提高越多，总活力损失越少，纯化效果就越好。 实际上，纯化倍数与回收率不节能兼顾，两者存在一定的矛盾，如盐析操作时，沉淀范围越宽，酶活回收率越高，但是纯化倍数却越低。在实际操作过程中应根据具体情况选择适宜的方法。较好的重现性是评价酶分离纯化方法的必要条件，操作材料要有较好的稳定性，操作条件要容易控制。酶分子的化学修饰：可以定义为在体外利用修饰剂所具有的的各类化学基团的特性，直接或经一定的活化步骤后与酶分子上的某种氨基酸残基（一般尽可能选用非酶活必需基团）产生化学反应，从而改造酶分子的结构与功能。酶分子修饰：指通过对主链的剪接切割和侧链的化学修饰对酶分子进行改造。酶分子修饰方法：（一） 金属离子置换修饰：过程①酶的分离纯化②除去原有的金属离子③加入置换离子（二） 大分子修饰（共价/非共价）采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性与功能的方法。过程：①修饰剂的选择②修饰剂的活化③修饰④分离（三） 台联有限水解修饰 （四）分子侧链的修饰 （五）氨基酸置换修饰（六）物理修饰（七）酶分子的亲和修饰固定化酶：指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。“长效的酶”优点：①多数情况下，酶经固定化后稳定性提高②固定化酶催化的反应过程更易控制③固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反应的连续化和自动化操作④固定化酶与游离酶相比更适于应用多酶体系。“无公害催化剂”缺点：①固定化可能造成酶的部分失活，酶活力损失②酶催化微环境的改变可能导致反应动力学发生改变③固定化使酶的使用成本增加，工厂的初始投资增大④固定化酶一般只适用于水溶性的小分子底物，不适宜大分子底物⑤固定化酶与完整菌体细胞相比，不适于多酶反应，特别是需要辅助因子参加的反应⑥胞内酶进行固定化时必须经过酶的分离纯化操作酶的固定方法：吸附法、包埋法、共价键结合法、交联法固定化酶的形状与性质 P195固定化酶（细胞）的活力酶反应器：以酶或固定化酶作为催化剂进行酶催化反应的装置。分罐式、管式和膜式。根据反应物状态分为均相酶反应器和固定酶反应器；按操作方式分批式/连续/流加式操作。参数logP:该参数用以描述有机溶剂的极性与酶活力之间的关系，其中P值为溶剂在正辛醇和水肿的分配系数，logP越大，溶剂的疏水性越强，logP越小，溶剂亲水性越强PH记忆：酶的反应速度与其冷冻干燥前水溶液的PH密切相关，反应得最适PH接近于水溶液中的最适PH，即有机溶液中的酶能够记忆它冷冻干燥或丙酮沉淀前所在缓冲液PH酶合成调节的机制：①单一效应物调节②两种效应物的共同调节③弱化调节金属离子在酶调节中的作用：酶活性中心的组成部分②金属离子在酶与底物间起桥梁作用③维持酶的空间构象46.酶的成产方法？（一） 提取分离法特点：自然界生物材料多样且十分广泛，价格也相对便宜该生产方法受制与生物资源、地理环境、气候条件等因素，产量低，难以满足实际生产的需要，价格成本也较生物合成法高，适用于目前还难以实现生物合成或化学合成的酶（二） 生物合成法（三） 化学合成法特点:化学合成的成本高，而且只能合成那些化学结构已经清楚的酶，使化学合成法受到限制，难以实现工业化生产，可生产既有酶的催化特点，又克服酶化不足的高效非酶催化剂等。发酵产酶的主要方法？各有何特点？（一） 分批发酵：指经灭菌的培养基在接种后开始培养直到结束。优点：操作简单，周期短，染菌的机会减少，生产过程、产品质量易掌握。缺点：对基质浓度敏感的产物或次级代谢物，采用分批发酵不合适，因其周期较短，一般在1-3d，产率较低。（二） 补料--分批发酵：在分批发酵过程中，补充因维持声场或产物合成所需的养分和前体优点：它能在这样一种系统中维持很低的基质浓度，从而避免快速利用碳源的阻遏效应和能够按设备的通气能力去维持适当的发酵条件，有利于次生代谢产物的累积，并减缓有害代谢物的不利影响 缺点：只有料液的输入，没有输出，发酵液的体积在增加（三） 半连续发酵：指过程中除了补料，还间歇排放部分发酵液。优点：克服补料带来的体积增加的问题，可减少有害代谢物的不断累积，尽可能延长产物合成的时间。缺点：其在放掉发酵液的同时，也损失了未利用的养分和处于生产旺盛的菌体，定期补充和放液会使发酵液稀释，送去提炼的发酵液体积更大，提取工艺的负荷会增加，可能产生更多的代谢有害物。.（四） 连续发酵：经一段时间的分批培养后，发酵过程中一面不断地补入新鲜的料液，一面以详尽的流速去除发酵液，基本维持发酵液体积不变。 优点：产酶效率高，生产稳定性好，易于实现自动化 缺点：污染杂菌机会大，菌种退化可能性大（五） 高细胞密度培养发酵产酶的优点：①微生物种类繁多，可以根据实际情况进行优选，满足不同生产微生物极易诱变，筛选，为优良菌株的选育提供捷径③微生物容易培养，培养基来源广，成本低④私产酶活力高，繁殖快，周期短⑤利用现代发酵技术可实现自动化、连续化、规模化生产⑥微生物的基因组较小，进行基因操作相对容易，为现代分子生物学在食品酶生产的应用提供了良好的平台发酵产酶的三大步骤：①产菌酶活细胞的获得②控制发酵③分离提取优良产酶菌的特点：①产酶效率和产酶量高 ②容易培养和管理，适合高密度发酵目的酶的活性高④产酶稳定性好，不易退化⑤利于酶的分离纯化⑥安全可靠无毒性产菌酶的获得：①自然界中分离②产酶菌的诱变育种③产酶菌的杂交育种④基因工程菌酶生物合成的模式？有何特点？每个模式可通过哪些措施提高酶产量？（一） 同步合成型：指酶的生物合成与细胞生长同步进行的生物合成模式特点：该合成型的酶，其生物合成伴随着细胞的生长而开始；在细胞进入旺盛生长期时，酶大量生成，当细胞进入平衡期后，酶的合成随着停止。※※提高酶产量措施：必须提高培养体系中高活力细胞的数量，采用最适宜的培养基，建立最合适产酶菌生长繁殖的培养条件，并在细胞进入平衡期后及时终止发酵，进行酶的分离提纯（尽量提高对应mRNA的稳定性）（二） 延续合成型：酶的生物合成从细胞的生长阶段开始，进入平衡期后，还可延续合成较长时间特点：延续合成型的酶，其生物合成可以受诱导物的诱导，一般不受分解代谢物阻遏，酶在生长达到平衡期后，仍可延续合成。mRNA相当稳定措施：不仅要提高产酶菌的生长状况，获得更多的高活力的细胞数量，还要防止阻遏物的影响，在进入平衡期后，尽量延长产酶时间和产酶效率（三） 中期合成型：酶一般在C生长一段时间后开始合成，进入平衡期后，酶合成停止。特点：酶的生物合成受到产物的反馈阻遏作用或分解代谢物阻遏作用，且编码酶的mRNA稳定性较差 ※※提高产酶量的措施：注意选育抗反馈阻遏或抗分解代谢的变异菌株，要注意控制反馈阻遏或者分解代谢阻遏（提高mRNA稳定性及接触阻遏）（四） 滞后合成型：酶在C生长一段时间或进入平衡期