第四章补充沉淀分离与结晶

第四章补充沉淀分离与结晶第一页，共六十页，编辑于2023年，星期一通过改变溶液条件，使溶质的溶解度降低而以固体形式从溶液中分离出的一种操作技术。盐析法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法结晶法2第二页，共六十页，编辑于2023年，星期一第一节盐析法

(saltprecipitation)定义：盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。优点：简单、经济、较少变性缺点：分辨率不高，要除盐3第三页，共六十页，编辑于2023年，星期一两种现象：盐溶：低盐情况，盐离子强度的增高，蛋白质溶解度增大盐析：高盐，盐离子强度增加，蛋白质溶解度减小4第四页，共六十页，编辑于2023年，星期一蛋白质盐析向蛋白质溶液中加入一定浓度的无机盐[(NH4)2SO4或Na2SO4]溶液后，可以使蛋白质凝聚而从溶液中析出，这种作用就叫做盐析。这样析出的蛋白质仍可以溶解在水中，而不影响原来蛋白质的性质。因此，盐析是一个可逆的过程。利用这个性质，可以采用多次盐析的方法来分离、提纯蛋白质。第五页，共六十页，编辑于2023年，星期一蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。第六页，共六十页，编辑于2023年，星期一由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同，从而使之从其他蛋白中分离出来。简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。盐析法简单方便，可用于蛋白质抗原的粗提、丙种球蛋白的提取、蛋白质的浓缩等。盐析法提纯的抗原浓度不高，只用于抗原的初步纯化。第七页，共六十页，编辑于2023年，星期一一、基本原理8第八页，共六十页，编辑于2023年，星期一原理1.形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，排斥作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。2.中性盐的亲水性比蛋白质大，使蛋白质脱去了水化膜，使其沉淀。9第九页，共六十页，编辑于2023年，星期一蛋白质溶解度与离子强度关系logS=-Ks

S——蛋白质溶解度，g/L；—盐离子强度,Ci——i离子浓度，mol/L；Zi——i离子化合价；——常数,为纵坐标上的截距;Ks——盐析常数。10第十页，共六十页，编辑于2023年，星期一、KS为纵坐标上的截距，是外推截距，与无机盐种类无关。KS是盐析常数，与蛋白质和盐的种类有关，但与温度和pH无关。两种类型：（1）在一定的pH和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析，称作Ks盐析法。（2）在一定离子强度下仅改变pH和温度进行盐析，称作β盐析法。11第十一页，共六十页，编辑于2023年，星期一（一）、无机盐的种类盐析能力：半径小的高价离子在盐析时的作用较强，阴离子的盐析效果比阳离子好，尤其以高价阴离子更为明显。

PO43-＞SO42―＞CH3COO―＞Cl―＞NO3―＞I―

NH4+＞K+＞Na+＞Li+

盐析用盐要考虑几个因素：常用硫酸铵12二、影响盐析的因素第十二页，共六十页，编辑于2023年，星期一(二）溶质（蛋白质等）种类的影响13第十三页，共六十页，编辑于2023年，星期一（三）蛋白质浓度的影响蛋白质浓度提高，盐用量减少。14第十四页，共六十页，编辑于2023年，星期一（四）温度的影响温度的变化会影响值。在无盐或稀盐溶液中，大多数蛋白质溶解度是随温度升高而增大的，但在高盐溶液中常相反。

15第十五页，共六十页，编辑于2023年，星期一（五）pH的影响当溶液的pH在蛋白质等电点附近时，值最小。利用值最低点时pH的不同，可以分级沉淀蛋白质.16第十六页，共六十页，编辑于2023年，星期一(六)盐的饱和度不同蛋白质的盐析要求的盐的饱和度不一样；分段盐析法。第十七页，共六十页，编辑于2023年，星期一三、盐析基本操作

1.中性盐的选择；2.pH的选择；3.温度与时间的控制；4.饱和度。18第十八页，共六十页，编辑于2023年，星期一（二）盐析方法和注意事项

1、分步盐析法2、重复盐析法3、反抽提法一定的盐浓度下将目的蛋白夹带一定量的杂蛋白一同沉淀。将沉淀用较低浓度盐溶液平衡，溶出其中的杂蛋白。19第十九页，共六十页，编辑于2023年，星期一分部盐析法20第二十页，共六十页，编辑于2023年，星期一反抽提法(RNA聚合酶)21第二十一页，共六十页，编辑于2023年，星期一注意事项“局部过浓”

：少量多次加入；

温度（室温）加入方法：1.固体法：搅拌下，少量多次加入；2.饱和溶液法:在蛋白质溶液中加入预先调好pH的（NH4)2SO4溶液；3.透析法:将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的（NH4)2SO4溶液中，通过透析作用改变蛋白质溶液中的盐浓度。使用于小体积样品。

22第二十二页，共六十页，编辑于2023年，星期一第二节有机溶剂沉淀

(OrganicSolventPrecipitation)

定义：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。23第二十三页，共六十页，编辑于2023年，星期一1、降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。

2、水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。24一、基本原理第二十四页，共六十页，编辑于2023年，星期一一些溶剂的介电常数

25第二十五页，共六十页，编辑于2023年，星期一优点：乙醇等有机溶剂易除去，产品更纯净；密度差较大，可通过离心收集。缺点：容易使蛋白质变性，操作常需低温，成本高，需防火防爆。26第二十六页，共六十页，编辑于2023年，星期一二、影响沉淀效果的因素（一）有机溶剂种类及用量常用的溶剂有乙醇、丙酮、甲醇等。

（二）pH的影响许多蛋白质在等电点附近时溶解度最低，溶液pH应在等电点附近，还须考虑蛋白质的稳定性。

27第二十七页，共六十页，编辑于2023年，星期一（三）温度（低温沉淀）有机溶剂存在下，大多数蛋白质的溶解度随温度降低而显著地减小。（四）无机盐的含量低盐：有利于沉淀，还有保护蛋白质，防止变性。

高盐：增大蛋白质在有机溶剂―水溶液中的溶解度，沉淀物中可能夹带盐。

28第二十八页，共六十页，编辑于2023年，星期一

多价阳离子，如Ca2+、Zn2+能与蛋白质结合形成复合物，使蛋白质溶解度降低。

胰岛素精制：

29（五）某些金属离子的助沉淀作用第二十九页，共六十页，编辑于2023年，星期一（六）样品浓度

浓度小时，增加溶剂投入量和损耗。浓度大时，增加共沉作用，降低分辨率。蛋白质浓度0.5%～2%；粘多糖浓度1%～2%。30第三十页，共六十页，编辑于2023年，星期一第三节其它沉淀方法

一、等电点沉淀法对于两性物质，等电点时净电荷为零，分子间排斥电位降低，吸引力增大，能相互聚集起来，发生沉淀。

31第三十一页，共六十页，编辑于2023年，星期一胰岛素纯化：胰岛素

pH8

除去碱性杂蛋白

pH3

除去酸性杂蛋白32第三十二页，共六十页，编辑于2023年，星期一蛋白质等电点沉淀在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。等电点时的许多物理性质如黏度、膨胀性、渗透压等都变小，从而有利于悬浮液的过滤。第三十三页，共六十页，编辑于2023年，星期一金属离子沉淀：与生物分子的酸性功能团作用的金属复合盐法；有机酸沉淀:与生物分子的碱性功能团作用的有机酸复合盐法（如苦味酸盐、苦酮酸盐、单宁酸盐等）。34二、成盐沉淀法第三十四页，共六十页，编辑于2023年，星期一

1．金属离子沉淀：

Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+等；

2．生成有机酸类复合盐沉淀（1）单宁即鞣酸（2）雷凡诺（3）三氯乙酸（TCA）35第三十五页，共六十页，编辑于2023年，星期一

雷凡诺

36第三十六页，共六十页，编辑于2023年，星期一猪心提取液洗脱液上清液上清细胞色素C

沉淀（去除）37吸附人造沸石盐析45%饱和硫酸铵沉淀TCA透析第三十七页，共六十页，编辑于2023年，星期一三、亲和沉淀

利用亲和反应原理，将配基与可溶性的载体偶联后形成载体-配基复合物（亲和沉淀剂），该复合物可选择性地与蛋白质结合，在一定条件下沉淀出来。

中性可溶，酸性沉淀。38第三十八页，共六十页，编辑于2023年，星期一

39第三十九页，共六十页，编辑于2023年，星期一四、高分子聚合物沉淀水溶性非离子型高分子聚合物，如不同分子量的聚乙二醇（PEG）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯等，能使蛋白质水合作用减弱而发生沉淀。五、表面活性剂沉淀十六烷基三甲基季胺溴化物（CTAB）十六烷基氯化吡啶（CPC）40}酸性多糖第四十页，共六十页，编辑于2023年，星期一41第四十一页，共六十页，编辑于2023年，星期一六、选择性变性沉淀法热变性沉淀法酸碱变性沉淀法利用试剂（氯仿）42第四十二页，共六十页，编辑于2023年，星期一第四节结晶(crystallization)

定义：溶液中的溶质在一定条件下因分子有规则的排列而结合成晶体。

通过结晶，溶液中的大部分杂质会留在母液中，经过滤、洗涤可得到纯度高的晶体。

43第四十三页，共六十页，编辑于2023年，星期一结晶的方法一般有2种：一种是蒸发溶剂法，它适用于温度对溶解度影响不大的物质。沿海地区“晒盐”就是利用的这种方法。另一种是冷却热饱和溶液法。此法适用于温度升高，溶解度也增加的物质。如北方地区的盐湖，夏天温度高，湖面上无晶体出现；每到冬季，气温降低，石碱(Na2CO3·10H2O)、芒硝(Na2SO4·10H2O)等物质就从盐湖里析出来。在实验室里为获得较大的完整晶体，常使用缓慢降低温度，减慢结晶速率的方法。第四十四页，共六十页，编辑于2023年，星期一晶体在一定条件下所形成的特定晶形，称为晶习。向溶液添加或自溶液中除去某种物质(称为晶习改变剂)可以改变晶习，使所得晶体具有另一种形状。这对工业结晶有一定的意义。晶习改变剂通常是一些表面活性物质以及金属或非金属离子。第四十五页，共六十页，编辑于2023年，星期一一、结晶过程指溶质自动从过饱和溶液中析出形成新相的过程。C2

—

小晶体的溶解度；C1

—

普通晶体的溶解度；ρ

—

晶体密度；M

—

晶体质量；σ—

晶体与溶液间的界面张力；

γ2

—

小晶体的半径；

γ1

—

普通晶体的半径；46第四十六页，共六十页，编辑于2023年，星期一结晶包括三个过程：(1)形成过饱和溶液;(2)晶核形成;(3)晶体生长。47第四十七页，共六十页，编辑于2023年，星期一晶核生成（成核）和晶体生长两个阶段，两个阶段的推动力都是溶液的过饱和度（溶液中溶质的浓度超过其饱和溶解度之值）。晶核的生成有三种形式：即初级均相成核、初级非均相成核及二次成核。在高过饱和度下，溶液自发地生成晶核的过程，称为初级均相成核；溶液在外来物（如大气中的微尘）的诱导下生成晶核的过程，称为初级非均相成核；而在含有溶质晶体的溶液中的成核过程，称为二次成核。二次成核也属于非均相成核过程，它是在晶体之间或晶体与其他固体（器壁、搅拌器等）碰撞时所产生的微小晶粒的诱导下发生的。第四十八页，共六十页，编辑于2023年，星期一浓度温度图49第四十九页，共六十页，编辑于2023年，星期一二、过饱和溶液的形成(结晶方法)（一）、蒸发法、冷却法（二）、温度诱导法（三）、盐析结晶法（四）、透析结晶法（五）、有机溶剂结晶法50第