第四讲分子的酶切

第四讲分子的酶切第一页，共四十四页，编辑于2023年，星期一第二讲DNA分子酶切与连接EnzymeDigestionandLigation第二页，共四十四页，编辑于2023年，星期一基因工程工具酶1DNA分子酶切2TableofContents本讲内容第三页，共四十四页，编辑于2023年，星期一1基因工程工具酶IntroductionofGeneticEngineeringEnzymes第四页，共四十四页，编辑于2023年，星期一基因工程工具酶基因工程工具酶指在分子水平上进行基因工程操作时，使用的有助于操作完成的酶类,如限制性内切核酸酶、连接酶、聚合酶等。酶的本质是蛋白质。第五页，共四十四页，编辑于2023年，星期一工具酶功能限制性核酸内切酶识别特一序列，切割DNA。DNA连接酶催化DNA中相邻的5’磷酸基和3’羟基之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。DNA聚合酶I合成双链cDNA的第二条链。缺口平移制作高比活探针。DNA序列分析。填补3’末端。反转录酶合成cDNA。替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析。多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5’羟基末端磷酸化，或标记探针。末端转移酶在3’羟基末端进行同质多聚物加尾。碱性磷酸酶切除末端磷酸基。重组DNA常用工具酶第六页，共四十四页，编辑于2023年，星期一2DNA分子酶切RestrictionEndogenousDigestion2.1限制性核酸内切酶概述2.2限制性核酸内切酶的类型2.3限制性核酸内切酶的命名2.4Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性2.5Ⅱ型限制性核酸内切酶的反应条件2.6影响限制性核酸内切酶活性的因素第七页，共四十四页，编辑于2023年，星期一限制性核酸内切酶是一种存在于细菌体内的，能在特异的酶切位点上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段，又称为“分子手术刀”。2.1限制性核酸内切酶概述第八页，共四十四页，编辑于2023年，星期一限制性内切酶切割DNA示意图EcoRIKpnISmaIEcoRIKpnISmaICKCK第九页，共四十四页，编辑于2023年，星期一核酸酶分类核酸酶核糖核酸酶(RNase)-RNA脱氧核糖核酸酶(DNase)-DNA核酸酶(Nuclease)-DNA/RNA核酸外切酶(Exonuclease)核酸内切酶(Endonuclease)作用对象作用位置第十页，共四十四页，编辑于2023年，星期一核酸外切酶与内切酶从核酸分子链条末端顺次水解磷酸二酯键，而将核苷酸切开，生成单核苷酸的酶。核酸外切酶(exonuclease)从核酸分子链内部水解磷酸二酯键，而将核酸链切断，生成寡核苷酸链的酶。核酸内切酶(endonuclease)第十一页，共四十四页，编辑于2023年，星期一核酸酶切割方式3’5’GCAATGCTTAGCCATCGTTACGAATCGGTA核酸外切酶核酸内切酶核酸外切酶第十二页，共四十四页，编辑于2023年，星期一限制性内切酶切割DNA的机制PHOCCH2OHT水解第十三页，共四十四页，编辑于2023年，星期一3亚基组成。多功能：内切酶、甲基化酶、ATP酶、DNA解旋酶。识别和结合于特定的DNA序列位点，随机切断在识别位点以外的DNA序列，距识别位点约1000bp不适用于基因工程。I性单一条肽链构成，单功能，活性仅需Mg2+。特异性识别并切割DNA。切割位点位于识别位点序列范围内。应用最广的限制性内切酶，通常重组DNA操作中内切酶即指此。II型二亚基蛋白质，双功能：既有内切酶活性，又有修饰酶活性。切断位点在识别序列周围25-30bp范围内，分子克隆操作中无实用意义。III型2.2限制性核酸内切酶的类型第十四页，共四十四页，编辑于2023年，星期一三类限制性核酸内切酶特性比较特性I型II型III型限制性修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATPMg2+SAMMg2+ATPMg2+SAM识别序列特异性、非对称特异性、旋转对称特异性、非对称切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近距识别序列下游24-26bp处切割方式随机切割特异切割随机切割第十五页，共四十四页，编辑于2023年，星期一2.3限制性核酸内切酶的命名基本名菌株名属名首字母大写;种名头二字母小写;斜体表示。特殊菌株中酶在基本名后加株名首字母，正体表示。噬菌体（病毒）或质粒基因编码酶用一个大写正体字母表示此染色体外遗传成份。同菌株中多个酶用罗马数字表示酶的发现先后次序。非染色体编码酶名酶序名系统酶名称：限制性核酸内切酶的系统名称为R，甲基化酶为M。如R.HindIII表示限制性核酸内切酶，相应甲基化酶用M.HindIII表示。第十六页，共四十四页，编辑于2023年，星期一限制性核酸内切酶命名示例(流感嗜血杆菌d株I)HaemophilusinfluenzaedI属名H种名in株名d序名IHindI第十七页，共四十四页，编辑于2023年，星期一2.4Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性单链多肽，最适pH为6～8。1切割需Mg2+激活，巯基有保护作用。2NaCl对其有抑制作用。3热不稳定，通常溶于50％甘油缓冲液中，贮于–20℃，取出使用须冰浴中放置。4识别与切割序列有严格特异性，基因工程中广泛应用。5第十八页，共四十四页，编辑于2023年，星期一Ⅱ型限制性核酸内切酶的用途1DNA重组2限制酶（物理）图谱绘制3基因组突变分析（RFLP分析）4限制酶的部分酶切与完全酶切第十九页，共四十四页，编辑于2023年，星期一Ⅱ型限制性核酸内切酶的识别序列EcoRⅠ：5’…GAATTC…3’3’…CTTAAG…5’HindII：5’…GTYRAC…3’3’…CAYRGT…3’严格专一型非严格专一型（Y:C/T，R:A/G）识别序列具有双重旋转对称的回文结构，长度一般4-6个碱基对。识别序列分为严格专一型和非严格专一型。第二十页，共四十四页，编辑于2023年，星期一Ⅱ型限制性核酸内切酶的识别序列NotⅠ：5’…GCGGCCGC…3’

3’…CGCCGGCG…5’XcmⅠ：5’…CCANNNNNNNNNTGG…3’3’…GGTNNNNNNNNNACC…5’稀有切割限制酶少数酶可识别6个以上的核苷酸序列。第二十一页，共四十四页，编辑于2023年，星期一Ⅱ型限制性核酸内切酶的识别序列

切割频率完全随机情况下，某种限制性内切酶识别序列出现的频率为1/4n,n为识别序列的核苷酸数目。6个碱基切割频率=46=4096第二十二页，共四十四页，编辑于2023年，星期一Ⅱ型限制性核酸内切酶的切割方式大多数Ⅱ型限制性核酸内切酶均在识别位点内部切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3’位的酯键，产生3’端为羟基、5’端为磷酸基团的片段。三种类型切割方式平头末端5’突出黏性末端3’突出黏性末端第二十三页，共四十四页，编辑于2023年，星期一酶切产生平头末端5’…G-C-T-C-A-G-OHP-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-POH-G-A-C-C-T-C…5’5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃第二十四页，共四十四页，编辑于2023年，星期一酶切产生5’突出黏性末端-C-T-G-OHG…3’-G-A-C-T-T-A-A-PP-A-A-T-T-C-G-A-’OH-G-C-T-EcoRI37℃-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A--G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-5’3’3’5’第二十五页，共四十四页，编辑于2023年，星期一酶切产生3’突出黏性末端PstI37℃-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C5’3’P-G-G-A-H-A-C-G-T-C-C-T-G-C-T-C-T-G-C-A-OH-G-A-G-P5’3’第二十六页，共四十四页，编辑于2023年，星期一限制性内切酶切割DNA的结构机制EcoRI（GAATTC）切割特异性DNA结构BamHI（GGATCC）与非特异性DNA结构BamHI切割特异性DNA结构第二十七页，共四十四页，编辑于2023年，星期一常用的部分限制性内切酶第二十八页，共四十四页，编辑于2023年，星期一练习：质粒DNA酶切请用XhoI对该质粒进行酶切，可以切成多少个片段？每个片段大小是多少？第二十九页，共四十四页，编辑于2023年，星期一两种特殊的限制酶来源于不同微生物，识别位点与切割位点均相同的酶。同裂酶来源于不同微生物，识别位点不同，但酶切后产生相同的黏性末端。两种同尾酶切割产生的黏性末端可彼此连接起来。同尾酶HpaII(C↓CGG)MspI(C↓CGG)/(Cm↓CGG)BamHI(G↓GATCC)BglII(A↓GATCT)第三十页，共四十四页，编辑于2023年，星期一常见同裂酶列表第三十一页，共四十四页，编辑于2023年，星期一同尾酶切割后连接同尾酶切割后连接后，原来的酶切位点将不存在，不能被原来的酶再进行切割。第三十二页，共四十四页，编辑于2023年，星期一常见同尾酶列表第三十三页，共四十四页，编辑于2023年，星期一2.5II型限制性核酸内切酶反应的条件DNA模板内切酶缓冲液ddH2O反应体系恒温酶切终止反应电泳检测混匀37℃10mMEDTA,65/80℃处理20min，或纯化。第三十四页，共四十四页，编辑于2023年，星期一限制性内切酶单位在合适的温度和缓冲液中,20/50µl反应体系中，反应1小时，完全水解1µg标准DNA所需的酶量。1个活性单位（1U）第三十五页，共四十四页，编辑于2023年，星期一缓冲液（Buffer）组成组分浓度盐浓度Tris-HCl50mMpH7.5盐浓度MgCl210mM10mM低盐酶NaCl0-150mM50mM中盐酶DTT1mM100mM高盐酶第三十六页，共四十四页，编辑于2023年，星期一示例：反应体系配制组分浓度单个反应体积Buffer10×Buffer2.0ulDNA100ng/ul10.0ulEnzyme10U/ul0.1ulddH2O-----7.9ul总体积-----20.0ul第三十七页，共四十四页，编辑于2023年，星期一酶切反应终止10mMEDTA(EDTA可鳌合镁离子),65℃或者80℃加热处理20min。1280℃处理也不失活的酶，可用苯酚/氯仿抽提去除，然后乙醇沉淀DNA；或用试剂盒纯化DNA。第三十八页，共四十四页，编辑于2023年，星期一完全酶切完全酶切内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。第三十九页，共四十四页，编辑于2023年，星期一部分酶切部分酶切只有部分酶切位点被切开。通过缩短反应时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化（部分酶切）的目的。第四十页，共四十四页，编辑于2023年，星期一2.6影响限制性核酸内切酶活性的因素因素原因解决措施酶的纯度其他核酸内外切酶污染、酶降解重新使用新酶DNA样品纯度杂质：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等纯化DNA加大酶的用量和反应总体积延长反应时间第四十一页，共四十四页，编辑于2023年，星期一2.6影响限制性核酸内切酶活性的因素因素原因解决措施DNA甲基化程度大肠杆菌DNA腺嘌呤甲基化酶（dam），在GATC序列中腺嘌呤N6位引入甲基，影响BclI、MboI等的活性。大肠杆菌DNA胞嘧啶甲基化酶（dcm），在CCAGG或CCTGG序列中胞嘧啶C5位引入甲基，影响EcoRII等的活性。使用甲基化酶缺失的菌株制备质粒DNA酶切温度与时间标准反应温度为37℃；部分酶反应温度不同：如SmaⅠ最适温度为25℃，TaqⅠ