HPV DNA检测标准操作程序

HPVDNA检测标准操作程序：1.目的：规范临床分子生物实验室对临床标本的处理，正确使用宏石PCR仪进行HPV-DNA扩增分析，以保证实验结果的准确性。2.适用范围：HPV-DNA的分型定性检测。3.试剂来源：凯普HPV23分型检测试剂盒。4.操作人：**5.本SOP变动程序：本标准操作程序的改动，可由任何一名使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。6.程序细则：6.1试剂盒组成：提取试剂盒：细胞裂解液（1.6ml/管）1管细胞保存液（16ml/瓶）1瓶PCR试剂盒：PCRmix1（560μl/管）1管PCRmix2（560μl/管）1管PCRmix3（560μl/管）1管PCRmix4（560μl/管）1管PCRmix5（560μl/管）1管PCRmix6（560μl/管）1管Taq酶（96μl/管）1管阳性对照（50μl/管）1管空白对照(250μl/管)1管6.2标准操作：6.2.1试剂的准备6.2.1在6只1.5mlEP管上分别标注PCRMasermix1-6。6.2.2取出6A个PCR管放在离心管架上，在管盖边缘上做好相应标识。注：A=样本数+3（空白对照、阳性质控、阳性DNA对照），每一轮试验中均需加入空白对照、阳性质控、阳性DNA对照，建议加样编号顺序如下：首先依次是不同的样本编号，最后为阳性质控、阳性DNA对照、与空白对照管（蒸馏水）。6.2.3从冰箱中取出PCR试剂盒，将PCRPremix融化后，与Taq酶管一起放入离心机中点动离心。6.2.4将试剂放入生物安全柜内，将已点动离心了的PCRpremix管、Taq酶管插在冰块上保持在低温条件下。6.1.6按照反应数计算所需的PCR各个组份的数量来准备PCRMastermix（可参照PCRMIX与酶混合比例如下表）。6.2.7在生物安全柜内，按已计算好的PCRpremix用量，从冰中取出相应的PCRpremix管吸取准确量后加入对应的1.5ml离心管中，将PCRpremix管放回冰块中。6.2.8垂直将枪头小心打入废液缸中，确保移液枪前臂没有碰到废液缸口。6.2.9从冰中取出Taq酶管，按计算好的用量（可参照PCRMIX与酶混合比例附表），吸取准确量后分别加入对应的1.5ml离心管中。6.2.10盖紧1.5ml离心管盖，同时将PCRpremix管及Taq酶管从超净台中取出放回-20℃冰箱的原包装中，标注已使用数量。6.2.11将已加入PCRpremix和Taq酶的1.5ml离心管在涡旋器上振荡5sec，放入离心机点动离心。6.2.12在生物安全柜中，将6种PCR混合液分装入对应的0.2mlPCR扩增管中，每管加入混合液18ul，加完后将所有PCR管盖盖上。6.3DNA提取6.3.1将临床样本及阴性对照品置室温下解冻，把标本编号，取出相应数量的样本管，对应编号。6.3.2将临床样本振荡混匀，伸入采集管底部吸取临床样本0.8ml至管底，13000rpm离心1分钟，弃上清。6.3.2.1细胞量不足时，可取临床样本量增大至2ml，多次离心以收集足够脱落细胞。6.3.2.2血细胞较多的临床样本，取细胞前延长振荡时间，离心收集细胞去上清后，可加入0.5ml双蒸水洗涤破坏红细胞。6.3.2.3粘液较多的临床样本，取细胞前延长振荡时间，为避免吸取粘液，必要时可将取样刷头取出后，吸取瓶底部液体。另要求医生在采样时尽量规范。如若吸取了粘液，在离心后可用小枪头去掉大部分粘液留下约20ul的液体。6.3.3加入0.5ml细胞保存液重悬浮细胞，13000rpm离心1分钟，尽量弃去大部分上清（可保留约20ul液体在底部）。6.3.4在样本管中加入50µl细胞裂解液，充分振荡后重悬浮细胞，煮沸10分钟。6.3.513000rpm离心10分钟，即制得样本DNA。取上清（上清中为释放的DNA）2µl作为PCR扩增的模板，其余放-20℃保存。备注：试剂盒中的阳性DNA对照可直接取2µl作为PCR扩增的模板，无需稀释。6.4加样上机6.4.1取出DNA样本后按照PCR管次序顺序摆放，放在离心管架上。6.4.2打开第一列PCR管的管盖，按照样本的编号顺序进行加样，盖上PCR管盖，垂直将枪头小心打入盛有2000mg/L次氯酸钠的废液缸中，确保移液枪前臂没有碰到废液缸口；(将DNA样本管放回原来的DNA样本的离心管架上，但确保摆放位置与还没有加样的DNA样本管有所区别)。6.4.3打开第二、三、四、五、六列PCR的管盖，加样操作同上4.5.2的操作。6.4.4对比已加PCR管的排列及DNA样本管的排列，确保样本加样无误。6.4.5加样顺序按照样本提取的顺序，吸取2ulDNA模板加入PCR管中，盖上PCR管盖。6.4.6放入微型离心机点动离心，确保去除每一个PCR反应管里的气泡。6.5PCR扩增6.5.1将PCR反应管放入PCR扩增区中的PCR扩增仪中，开始PCR反应，具体程序如下：6.5.2按照荧光PCR仪的仪器说明书设置以下相应的四个荧光检测通道（注：一个标本需要六个反应管）：6.5.3按照荧光PCR仪的仪器说明书对样本信息进行编辑。6.5.4对此次实验结果进行保存后，荧光PCR仪开始运行。6.5.5程序运行结束后，按照荧光PCR仪说明书调整各参数，并分析结果。6.6质量控制与结果判读6.6.1调整基线、阈值线：基线范围调整为5-13；防止与避免前5个循环扩增信号波动大而造成软件算法在基线默认情况下扩增曲线出现抬高的情况。调整阈值线，阈值线一般在0.03-0.12之间进行调整盖过空白对照和阴性质控的结果与大部分样本阴性结果（大概往上调整2-3毫米，此位置为指数增长期的拐点）。6.6.2质控对照的判读：6.6.2.1空白对照在各荧光检测通道Ct值均应显示为Undet。6.6.2.2阳性DNA对照的各扩增曲线（6条）呈S型，且在各荧光检测通道Ct值≤36。6.6.2.3阳性质控的扩增曲线呈S型，在反应液6的Cy5荧光检测通道Ct值≤40。符合以上三个条件，此次实验在控，结果有效。6.6.3临床样本结果判读6.6.3.1样本在其他5种反应液FAM、HEX、ROX、Cy5，以及反应液6FAM、HEX、ROX荧光检测通道Ct值显示为Undet，仅在反应液6的Cy5荧光检测通道Ct值≤40，即内对照β-globin在反应液6的Cy5荧光检测通道Ct值≤40，判断为阴性。6.6.3.2样本其内对照β-globin在反应液6的Cy5荧光检测通道Ct值≤40，在其他相应的FAM、HEX、ROX、Cy5荧光检测通道Ct值≤40，判断为对应的阳性。6.6.3.3样本其内对照β-globin在反应液6的Cy5荧光检测通道Ct值≤40，在其他相应的FAM、HEX、ROX、Cy5荧光检测通道40＜Ct值＜45者，建议复查重做。重做结果为Ct值≤40者为阳性，否则为阴性。6.6.3.4样本在各荧光检测通道Ct值显示为Undet，需要复查，其复查结果仍为各荧光检测通道Ct值显示为Undet，判断为无效，需重新采样。6.6.3.5如果出现Ct值＜15的强阳性标本，可直接报告为阳性或自动分析，并将其从样样本中剔除，再按上面步骤分析其他样本，或建议进行1/100稀释重做。备注：因存在一些说明书以外的实验结果疑问，现根据试剂厂家的生产质检与技术指导意见进行结果判读的补充：6.6.3.6样本其内对照β-globin在Cy5荧光检测通道40＜Ct值＜45其他相应tFAM、HEX、ROX、Cy5荧光检测通道Ct值显示为Undet，建议复查重做。其复查结果仍与上次结果一致，判断为无效，需重新采样。6.6.3.7样本在反应液6的FAM、HEX、ROX荧光检测通道Ct值≤25，其内对照β-globin在Cy5荧光检测通道40＜Ct值＜45或为undet，判断为阳性，其原因在于病毒的载量过高，扩增过程对β-globin的反应产生了抑制作用。6.6.3.8样本其内对照β-globin在Cy5荧光检测通道Ct值≤40，而其他相应的FAM、HEX、ROX、Cy5荧光检测通道35≤Ct值≤40，但其曲线为非典型的S型曲线，且荧光强度值较低（Rn≤0.3），需要复查重做，其复查结果情况仍与上次结果一致，判为阳性；否则为阴性。注：