第3章病毒和亚病毒1

发现时期：1886德国A.Mayer在荷兰发现烟草花叶病。1892年俄国学者依万诺夫斯基（D.Ivanovsky）认为花叶病原可通过细菌滤器，或为极小细菌。1898荷兰学者贝则林克（）称花叶病原为病毒。1900年前后，包括口蹄疫（footandmouthdisease）在内的多种动植物疾病病原体的滤过性特性被证明。当时称filterableviruses（滤过性病毒），后又命名为viruses（病毒）。病毒的发现和研究历史：第三章病毒和亚病毒因子当前第1页\共有85页\编于星期五\20点

病毒粒子的化学分析时期1935年斯坦莱（Stanley）提纯、结晶了烟草花叶病毒（TMV）

病毒的分子生物学研究时期

1952年Hershey和Chase证实噬菌体的遗传物质是DNA1955年Franenkel-Conrant完成了TMV的体外拆开重组实验

1965年美科学家Spiegelman第一次在体外用无细胞体系复制E.Coil的RNA噬菌体成功。第三章病毒和亚病毒因子

当前第2页\共有85页\编于星期五\20点非细胞生物（真）病毒：至少含核酸和蛋白质两种组分亚病毒因子类病毒：只含具侵染性的RNA组分拟病毒：只含有不具侵染性的RNA卫星病毒：与真病毒伴生的缺陷病毒卫星RNA；只含与侵染无关的RNA组分朊病毒：只含单一蛋白质组分当前第3页\共有85页\编于星期五\20点第一节病毒（Virus）特点：(p67)1、个体极小，可以通过滤菌器，形态多样。普通光镜下不可见，形态大小以nm计。2、无细胞结构，由蛋白质、核酸构成，无细胞器3、一个病毒体内仅含一种核酸（DNA,orRNA)

4、生活方式为专性活细胞内寄生，病毒酶系不全，离开活体后无生命特征；5、病毒以复制(replication)的方式增殖,包括核酸复制、核酸蛋白质装配，是在分子水平上进行的；6、在离体条件下，能以无生命大分子状态存，并可长期保持其侵染活力；7、对抗生素不敏感，对干扰素敏感；8、有些病毒的核酸还能整合到宿主的基因组中，并诱发潜伏性感染。当前第4页\共有85页\编于星期五\20点第三章病毒和亚病毒因子一、定义：迄今仍无一个科学而严谨的定义是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的超显微“非细胞生物”，其本质是一种只含DNA或RNA的遗传因子，它们能以感染态和非感染态两种状态存在。在宿主体内时呈感染态（活细胞内专性寄生），依赖宿主的代谢系统获取能量、合成蛋白质和复制核酸，然后通过核酸与蛋白质的装配而实现其大量繁殖；在离体条件下，它们能以无生命的生物大分子长期存在，并可保持其侵染活性。当前第5页\共有85页\编于星期五\20点分布：各种生物中，专性活细胞内的寄生物与人类关系：（1）至今人类和许多有益动物的疑难疾病和威胁性最大的传染病几乎都是病毒病；（2）发酵工业中的噬菌体（细菌病毒）污染会严重危及生产；（3）许多侵染有害生物的病毒则可制成生物防制剂而用于生产实践；（4）许多病毒还是生物学基础研究和基因工程中的重要材料或工具。当前第6页\共有85页\编于星期五\20点第三章病毒和亚病毒因子病毒的形态、大小（p68）1.病毒的形态①球形颗粒②杆状颗粒③复合状：2．病毒的大小直径20-200nm（100nm）病毒：细菌：真菌=1：10：100蝌蚪状砖状弹状当前第7页\共有85页\编于星期五\20点GeneralizedStructureofViruses当前第8页\共有85页\编于星期五\20点

病毒大小当前第9页\共有85页\编于星期五\20点当前第10页\共有85页\编于星期五\20点测量病毒大小的方法：超滤法电子显微法超速离心沉降法电泳法当前第11页\共有85页\编于星期五\20点病毒的化学组成1、核酸(p71)病毒核酸功能：指导病毒蛋白质的合成控制着病毒的遗传、变异、增值及对宿主的感染性对衣壳的形成与稳定也有一定的作用单链DNA（ssDNA）；双链DNA（dsDNA）；单链RNA（ssRNA）；双链RNA（dsRNA）；病毒核酸核酸是病毒的遗传物质；

一种病毒的毒粒只含有一种核酸：DNA或是RNA；当前第12页\共有85页\编于星期五\20点2、病毒的蛋白质(p68)病毒蛋白质结构蛋白非结构蛋白病毒基因组编码的，在病毒复制过程中产生并具有一定功能，但并不结合于毒粒中的蛋白质。构成一个形态成熟的有感染性的病毒颗粒所必需的蛋白质壳体蛋白；包膜蛋白；存在于毒粒中的酶；当前第13页\共有85页\编于星期五\20点构成病毒壳体，使病毒有一定大小形态，维持病毒结构。具保护作用，使核酸免受酶或其他理化因子的影响。参与病毒感染过程，决定宿主范围，表现为吸附作用。决定病毒的抗原性（将蛋白质注入体内，即预防病毒感染的原理）发生毒性反应的主要成分，对机体或细胞有毒性作用。构成了病毒组成中的酶病毒蛋白质功能：当前第14页\共有85页\编于星期五\20点3、脂质4、碳水化合物5、其他成分当前第15页\共有85页\编于星期五\20点衣壳(capsid)核酸(genome)衣壳粒(capsomere)衣壳核酸包膜（envelope）糖蛋白核衣壳(nucleocapsid)1、典型病毒的构造（p68)当前第16页\共有85页\编于星期五\20点病毒粒子核衣壳（基本构造）包膜（非基本构造）：脂类或脂蛋白构成核心（RNA，DNA）衣壳（蛋白质）当前第17页\共有85页\编于星期五\20点毒粒（病毒颗粒）：病毒的细胞外颗粒形式，也是病毒的感染性形式。当前第18页\共有85页\编于星期五\20点

1、螺旋对称体病毒2、病毒粒的对称机制（p68）当前第19页\共有85页\编于星期五\20点螺旋对称的代表—烟草花叶病毒TMV外形直杆状，长300nm，宽15nm，中空（内径为4nm）衣壳蛋白：95%，2130个亚基（衣壳粒），以逆时针方向作螺旋状排列。ssRNA：5%，6390个核酸，位于距轴中心4nm处以相等的螺距盘绕于蛋白质外壳内，3个核苷酸与1个蛋白质亚基相结合。由于其核酸有合适的蛋白衣壳包裹和保护，故结构十分稳定，甚至在室温下放置50年后仍不丧失其侵染力。TobaccoMosaicVirus当前第20页\共有85页\编于星期五\20点2、二十面体对称病毒第四章

病毒和亚病毒二十面体对称的代表—腺病毒当前第21页\共有85页\编于星期五\20点当前第22页\共有85页\编于星期五\20点3、复合对称当前第23页\共有85页\编于星期五\20点复合对称的代表—T偶数噬菌体当前第24页\共有85页\编于星期五\20点刺突tail

pinsheadnecktail（24环）尾丝(tailfibers)尾鞘基板尾管当前第25页\共有85页\编于星期五\20点当前第26页\共有85页\编于星期五\20点InfluenzaVirus–anEnvelopedViruswithaHelicalNucleocapsid

当前第27页\共有85页\编于星期五\20点3.病毒的群体形态1、病毒包涵体（inclusionbody）有四种类型：①是病毒的聚集体，核型多角体病毒（NPV），质型多角体病毒(CPV)②大多数由动物病毒引起的包涵体，是病毒的合成部位③是病毒蛋白和与病毒感染有关的蛋白质（例如植物病毒引起的包涵体）④非病毒性包含体：某些化学因子，甚至由于细菌感染也可引起包涵体的形成。应用：用于病毒病的诊断；用于生物防治。

当前第28页\共有85页\编于星期五\20点5、枯斑：叶子上出现的坏死灶即枯斑。2、噬菌斑：噬菌体连续重复感染细菌，使大量的细菌死亡，在培养细菌的平板上，可以看到一个个透亮不长细菌的小圆斑，称为噬菌斑。3、空斑：人工培养的单层动物细胞感染病毒后，也会形成类似噬菌斑的动物病毒群体，称为空斑。4、病斑：单层动物细胞受到肿瘤病毒的感染后，会使动物细胞恶性增生，形成类似细菌菌落的病灶，称为病斑。当前第29页\共有85页\编于星期五\20点当前第30页\共有85页\编于星期五\20点噬菌斑荧光假单胞菌当前第31页\共有85页\编于星期五\20点噬菌斑(plaque)下层培养基双层培养基敏感菌+上层培养基噬菌体稀释液培养噬菌斑噬菌斑敏感菌菌苔当前第32页\共有85页\编于星期五\20点当前第33页\共有85页\编于星期五\20点枯斑当前第34页\共有85页\编于星期五\20点三、病毒的增殖方式（p73）吸附侵入增殖成熟裂解当前第35页\共有85页\编于星期五\20点当前第36页\共有85页\编于星期五\20点（一）原核生物的病毒----噬菌体

一、定义能够侵染细菌、放线菌等原核微生物的病毒

二、形态和结构微球形噬菌体有三种形态蝌蚪形丝状当前第37页\共有85页\编于星期五\20点噬菌体的形态从形态学上可将噬菌体分为六群当前第38页\共有85页\编于星期五\20点

噬菌体的形态类型形状结构核酸噬菌体1蝌蚪形六角形头部可收缩性尾部dsDNAT2,T4,T62蝌蚪形六角形头部非收缩性长尾dsDNAT1,T5,λ3蝌蚪形六角形头部非收缩性短尾dsDNAT3,T74微球形六角形头部12个顶角各有一个较大壳粒ssDNAφX174S135微球形六角形头部12个顶角各有一个较小壳粒ssRNAf2,Qβ,MS26丝状丝状(线状)ssDNAM13当前第39页\共有85页\编于星期五\20点1、噬菌体的增殖（p73）噬菌体烈性噬菌体温和性噬菌体烈性噬菌体：侵入寄主后能引起寄主细胞发生裂解的噬菌体。温和噬菌体：侵入寄主后暂时不引起寄主细胞发生裂解。(一)

烈性噬菌体烈性噬菌体侵入寄主细胞后，按照噬菌体的遗传特性，借寄主细胞的生化机制，进行核酸复制和蛋白质的合成，形成各部件再组装成许多子代噬菌体的过程称为增殖。当前第40页\共有85页\编于星期五\20点（1）吸附(adsorption)不同的噬菌体有不同的吸附位点，据研究一个细菌的表面约有300个吸附点（2）侵入（penetration)尾管插入细胞壁和膜内，将核酸注入细胞（约数十秒钟）（3）增殖(replication)增殖过程包括核酸的复制和蛋白质的合成。噬菌体的核酸操纵寄主的代谢系统，为噬菌体合成原料，并在寄主细胞内装配噬菌体粒子。当前第41页\共有85页\编于星期五\20点（4）成熟（maturity）

此时，开始噬菌体粒子的装配、组合，DNA分子缩合通过衣壳包裹DNA而形成头部、尾部，最后装上尾丝。（5）裂解（释放）release

在脂肪酶溶解细胞膜和溶菌酶溶解细胞壁作用下从细胞内部促进了细胞的裂解。当前第42页\共有85页\编于星期五\20点当前第43页\共有85页\编于星期五\20点当前第44页\共有85页\编于星期五\20点当前第45页\共有85页\编于星期五\20点吸附(adsorption)吸附的机理：尾丝尖端与受体发生共价结合。当前第46页\共有85页\编于星期五\20点吸附(adsorption)影响因素：噬菌体数量；阳离子；辅助因子；温度。当前第47页\共有85页\编于星期五\20点当前第48页\共有85页\编于星期五\20点吸附当前第49页\共有85页\编于星期五\20点当前第50页\共有85页\编于星期五\20点2.侵入噬菌体核酸物质进入受体细胞。T类噬菌体收缩尾鞘，尾髓插入细胞壁，此时，尾管端携带的少量溶菌酶水解壁的肽聚糖，将DNA像注射一样打入细胞内。蛋白质的外壳仍在壁外。线状噬菌体fd则全部进入寄主细胞。当前第51页\共有85页\编于星期五\20点当前第52页\共有85页\编于星期五\20点增殖过程中基因表达的特点病毒核酸的复制病毒核酸的转录增殖3.增殖(replication)噬菌体核酸物质及蛋白质在寄主细胞内的合成。噬菌体以其核酸的遗传信息向宿主细胞发出指令并提供蓝图。当前第53页\共有85页\编于星期五\20点增殖过程中基因表达特点（p74）

基因表达有先有后基因表达的顺序为:早期表达;次早期表达;核酸复制;晚期表达前一次表达产物是后一次表达的mRNA聚合酶晚期表达的结果是合成了各种装配蛋白(另外还有溶菌酶)当前第54页\共有85页\编于星期五\20点dsDNA噬菌体的转录、翻译、复制增殖过程早期转录：先利用寄主的RNA多聚酶（细菌RNA聚合酶）转录噬菌体的mRNA，合成一系列新的早期蛋白质（次早期mRNA聚合酶，更改蛋白等）。4-8min中（次早）期转录：更改后的RNA多聚酶转录次早期的mRNA，合成次早期的蛋白质——DNA酶、DNA聚合酶、5-羟甲基胞嘧啶合成酶和晚期的mRNA多聚酶。6-15min在DNA聚合酶的作用下进行噬菌体核酸的复制晚期转录：转录晚期的后期mRNA，合成晚期的蛋白质。在T类噬菌体中，合成的后期蛋白质是噬菌体头和尾成分的亚单位，还有噬菌体的溶菌酶。然后开始噬菌体核酸的复制。在含有双股DNA的噬菌体中，复制过程与一般DNA复制相似。当前第55页\共有85页\编于星期五\20点核酸转录

蛋白质合成当前第56页\共有85页\编于星期五\20点

T4DNA复制的特点：

1、由于T4DNA中的胞嘧啶被羟甲基胞嘧啶取代，所以在其DNA复制之前，必须由噬菌体编码的酶合成羟甲基胞嘧啶，并且在T4DNA合成后，羟甲基胞嘧啶被葡萄糖基化，以保护T4DNA免遭E.coli核酸酶破坏。

2、在T4DNA复制过程中，由6—8个拷贝结合形成非常长的DNA链。(多连体)

当前第57页\共有85页\编于星期五\20点左图：病毒核酸链接入寄主核酸链

右图：病毒核酸复制病毒核酸的复制当前第58页\共有85页\编于星期五\20点病毒核酸的转录含±DNA的病毒:±DNA→mRNA+DNA病毒:+DNA→±DNA→mRNA含±RNA病毒:±RNA→mRNA含+RNA病毒:+RNA→±RNA→mRNA含-RNA病毒:-RNA→mRNA当前第59页\共有85页\编于星期五\20点4成熟（装配）

DNA分子的缩合通过衣壳包裹DNA而形成头部尾丝和尾部其它部件独立装配完成头部与尾部相结合装上尾丝当前第60页\共有85页\编于星期五\20点当前第61页\共有85页\编于星期五\20点成熟的病毒粒子从被感染细胞内转移到外界的过程。没有包膜的病毒合成溶解细胞的酶，引起内裂解。有包膜的病毒以下图方式进行：5、裂解（释放）当前第62页\共有85页\编于星期五\20点最后:大肠杆菌死亡并破裂，释放出里面的病毒，新一代病毒开始新的生命旅程

当前第63页\共有85页\编于星期五\20点（1）噬菌斑：在涂布有敏感宿主细胞的固体培养基表面，若接种上相应噬菌体的稀释液，其中每一噬菌体粒子由于先侵染和裂解一个细胞，然后以此为中心，再反复侵染和裂解周围大量的细胞，结果就会在菌苔上形成一个具有一定形状、大小、边缘和透明度的噬菌斑。（2）效价：这一名词在不同的场合有不同的涵义。在这里，效价表示每毫升试样中所含有的具侵染性的噬菌体粒子数。又称噬菌斑形成单位数或感染中心数。2.噬菌体效价的测定（p75）当前第64页\共有85页\编于星期五\20点

（3）双层平板法：底层平板（约2%琼脂培养基7-8ml）37℃

上层培养基（约1%琼脂培养基3ml）10余h计数上层平板宿主菌悬液（对数期菌液0.2ml）混匀

噬菌体试样（合适稀释液0.1ml）

用双层平板法计算出来的噬菌体效价总是比电镜直接计数得到的效价低。成斑率：同一样品根据噬菌斑计算出来的效价与用电镜计算出来的效价之比，称成斑率。当前第65页\共有85页\编于星期五\20点双层平板法琼脂平板菌液+噬菌体试样+琼脂培养基培养10天计数噬菌斑噬菌斑数=试样中噬菌体数当前第66页\共有85页\编于星期五\20点噬菌体增殖规律的描述方法离心术抗病毒血清培养定时取样测噬菌斑数一步生长曲线当前第67页\共有85页\编于星期五\20点3.一步生长曲线（p76）

定量描述烈性噬菌体

生长的三个重要特性参数

先将噬菌体与敏感的细菌混合发生吸附，未吸附的噬菌体以离心法或加抗血清除去；然后定时取样接种在有可裂解的敏感性细菌的平板上，经培养，以时间为横坐标，噬菌斑数为纵坐标绘图得到的曲线。2、三个时期1、定义当前第68页\共有85页\编于星期五\20点当前第69页\共有85页\编于星期五\20点裂解期——噬菌斑数突然直线上升，新噬菌体大量释出，直至所有感染细胞全部裂解潜伏期——从噬菌体吸附到细菌表面至出现新的噬菌体的最短时间（4个阶段：吸附、侵入、复制、组装）裂解量——每一宿主细胞产生平均子代噬菌体粒子的数量。裂解量=裂解期的噬菌斑数/潜伏期的噬菌斑数（细菌数）例：裂解量=2100/100=210噬菌斑粒子数/细菌稳定期——完全裂解后，噬菌斑数又趋稳定，曲线变平坦，称稳定期。当前第70页\共有85页\编于星期五\20点

4.溶源性温和性噬菌体定义整合到染色体上的噬菌体DNA叫原（前）噬菌体含原噬菌体的细菌称为溶源性细菌。温和噬菌体基因组形成原噬菌体的过程称为溶源化

凡吸附侵入菌体后，不立即裂解细菌细胞，而是将其核酸整合到寄主染色体上，进行同步复制，随细胞分裂传递给子代，并赋予菌细胞以新的性状。当前第71页\共有85页\编于星期五\20点溶源菌细菌的溶源性具有遗传性溶源菌对同源噬菌体具有免疫性溶源性细菌在培养中不易被查觉非溶源细胞自发裂解和诱导裂解：有少数噬菌体可自发或诱发裂解宿主细胞变成烈性噬菌体溶源性细胞可获得一些新的生理特性复愈:溶源菌失去前噬菌体白喉杆菌白喉毒素β－噬菌体宿主发病当前第72页\共有85页\编于星期五\20点

①复制（细菌的核酸和噬菌体的核酸同步复制）②可自发裂解（即少数溶源性细菌中温和性噬菌体变成了烈性噬菌体），几率10-6-10-8；③诱发裂解；几率10-3-10-5④免疫性（immunity）含有温和噬菌体的细菌可抵御外来噬菌体的侵染⑤复愈性，溶源菌在其增殖过程中10-5个细菌丧失前噬菌体，成为非溶源性细菌。溶源菌的特性：当前第73页\共有85页\编于星期五\20点（补充）温和噬菌体存在的形式游离态：成熟后被释放并有侵染性的游离噬菌体粒子。整合态：已整合到寄主基因组上的前噬菌体状态。营养态：前噬菌体经外界理化因子诱导后，脱离宿主核基因而复制、合成和装配状态。当前第74页\共有85页\编于星期五\20点LyticandLysogeniccycleofTemperatePhage当前第75页\共有85页\编于星期五\20点

八、非增殖性感染

增殖性感染（productiveinfection）

：病毒侵入寄主（敏感）细胞，该细胞允许病毒增殖的为增殖性感染。非增殖性感染（nonproductiveinfection）：病毒侵入寄主（敏感）细胞，由于该细胞或病毒的原因，病毒增殖受阻不能增殖的为非增殖性感染。主要方式和原因：1、流产感染（abortiveinfection）：病毒侵入寄主（敏感）细胞后，只能表达部分基因，不能完成病毒增殖的感染方式。原因：细胞为非允许性细胞，细胞缺少某种酶或病毒基因组不完整，而引起的。2、限制性感染（restrictiveinfection）

：病毒侵入寄主（敏感）细胞后，直到细胞变成允许性细胞，才能增殖；或细胞群中只有少数细胞可感染，病毒增殖水平很低。3、潜伏感染（latentinfection）：病毒侵入寄主（敏感）细胞后，病毒基因在寄主细胞内长期存在，并不增殖也不破坏细胞当前第76页\共有85页\编于星期五\20点

第三章病毒和亚病毒九、理化因素对病毒的影响1.物理因素

病毒在寄主外存在时，55-60℃病毒悬液几分钟内就变性；4℃可以保存一天，在-70℃可以保存几个月。X—射线、Y—射线、紫外线照射都能使病毒衣壳蛋白质变性失活，吸附功能降低，DNA氢键断裂。2.化学因素

乙醚、氯仿，去氯胆酸钠可以剥去病毒的外膜，防腐剂-漂白粉、甲醛等可以杀死病毒。诱变剂杀死病毒。带包膜的病毒容易被脂肪溶剂破坏；无包膜的病毒对多种常用的消毒剂抗性较强。当前第77页\共有85页\编于星期五\20点病毒的种类与分类1、病毒的种类根据宿主的不同将病毒分为噬菌体植物病毒昆虫病毒人类和脊椎动物病毒2、病毒的分类1995年国际病毒分类委员会第六次报道有4000多种，将目前的病毒分为七大类，3个目，62个科、11个亚科，164个属。2001年第七次报道：