2019年微生物检验第八章非发酵阴杆课件

第十七章

非发酵革兰阴性杆菌

?

是指一大群不发酵葡萄糖或仅以氧化形式利用葡萄糖的需氧，无芽胞的革兰阴性杆菌。

?

特别提示：并非分类概念

只为认识方便

?

生物习性相似

已经形成习惯

革兰阴性杆菌

OX+葡萄糖O/F葡萄糖O/F不动杆菌属

窄食单胞菌属

不利用

洛非不动杆菌

FO肠杆菌科

假单胞菌属

无色杆菌属

金色杆菌属

不利用

产碱杆菌

布鲁菌属

产碱假单胞

无色杆菌

FO气单胞

邻单胞

弧菌属

－

共有的几个特点

非发酵菌大多数为条件致病菌

主要引起抵抗力低下病人的机会感染，如败血症、呼吸道感染、尿路感染、伤口感染等。现已成为引起医院内感染的主要病原菌。

对抗生素有天然的抗药性

非发酵菌对抗生素常呈现多重耐药现象。如铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌、黄杆菌等对绝大多数抗生素耐药，铜绿假单胞菌对氨苄青霉素耐药率达100%，甚至对第三代头子孢菌素也呈现耐药，而且耐药率在逐年增加。

不发酵革兰阴性杆菌分类

?假单胞菌属

(Pseudomonas)?产碱杆菌属

(Alcaligenes)?不动杆菌属

(Acinetobacter)?莫拉菌属

(Moraxella)?无色杆菌属

(Achromobacter)?金氏杆菌属

(Kingella)?黄杆菌属

(Flavobacterium)?艾肯菌属

(Eikenella)?土壤杆菌属

(Agrobacterium)?黄单胞菌属

(Xanthomonas)?丛毛单胞菌属

(Comamonas)

常见非发酵革兰阴性杆菌的初步分群鉴定

试验

假单胞菌属

无色杆菌属

黄杆菌属

不动杆菌属

产碱杆菌属

丛毛菌属

莫拉菌属

氧化酶

+++/--+++/-O/F试验

O/-OOO/----动力

+/-+/-

+/-

-++-注：+：90%以上阳性；-10%以下的阳性；+/-：约70%为阳性；O：为氧化。

非发酵菌

嗜麦芽窄食单胞菌

葡萄糖产酸

无色杆菌属

土壤杆菌属

假单胞菌属

动力

+OXOX－

不动杆菌属

+葡萄糖产酸

黄色素

莫拉氏菌属

黄杆菌属

－

－

－

++端鞭毛

－

+－

++产碱杆菌属

尿素

－

+常见非发酵菌的鉴定双岐索引

?假单菌属按rRNA同源性分为5群及未确定rRNA同源群有关的种。

?一群需氧、不发酵葡萄糖、无芽胞，有鞭毛、氧化酶阳性的革兰阴性杆菌。

?多为条件致病菌。

第一节

假单胞菌属

临床常见假单胞菌分群

rRNA11.荧光假单胞菌DNA同源群

铜绿假单胞菌

荧光假单胞菌

恶臭假单胞菌

2.斯氏假单胞菌DNA同源群

斯氏假单胞菌

曼多辛假单胞菌

3.产碱假单胞菌DNA同源群

产碱假单胞菌

假产碱假单胞菌

2.临床意义

?分布广泛：水、土壤、空气

。

?人类感染的非发酵菌中，假单胞菌属占70%-80%，铜绿假单胞菌占55%-65%。

?常见的有嗜麦芽窄食单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、产碱假单胞菌等。

?这些细菌在医院内感染中亦常见。

3.微生物特性

?革兰阴性、无芽胞、专性需氧

?有端鞭毛或丛鞭毛

?生长温度范围广，最适生长温度为35℃

?产生各种水溶性色素：绿脓素、脓红素、荧光素、脓褐素。

?对理化因素耐受性较强，对多种抗生素耐药。

药敏试验药物选择

按CLSI(NCCLS)推荐，分为4组：

A组:头孢他啶，庆大霉素，美洛西林，替卡西林，哌拉西林。

B组:头孢吡肟，头孢哌酮，氨曲南，亚胺培南，阿米卡星，妥布霉素，环丙沙星。

C组:头孢噻肟，头孢曲松，氯霉素

D组或U组：羧苄西林，头孢唑肟，四环素，诺氟沙星，氧氟沙星，磺胺甲基异恶唑。

?在自然界分布较为广泛，适应能力强。

?常引起感染：皮肤、呼吸道、泌尿道、烧伤感染等。慢性肺部感染极为常见。

?菌血症、心内膜炎、肺囊性纤维变。

?眼部感染导致角膜穿孔而失明。

二、铜绿假单胞菌

铜绿假单胞菌的毒力因子

粘附素：粘附

结构成分

多糖似荚膜物质

毒素

内毒素：LPS

毒力因子

外毒素：A阻止真核细胞蛋白质合成

S干扰吞噬杀菌作用

绿脓素：具有氧化还原活性，催化超氧化物和

过氧化氢产生有毒基团

酶类

弹性蛋白酶:丝氨酸蛋白酶（Las-A）

降解弹性锌金属蛋白酶（Las-B）蛋白

磷脂酶C:分解脂质和卵磷脂，损伤组织细胞

2.生物学特性

形态与染色

为无芽胞细长的革兰氏阴性杆菌，菌体长短不一，短的呈球杆状，长的为丝状。成对排列或形成短链。无荚膜，在菌体一端有1根鞭毛，运动活泼。革兰氏染色阴性，无抗酸性。

培养特性

?专性需氧菌。生长温度范围为20-42℃;最适温度为35℃

，致病性菌可在42℃

生长，但在4℃

不生长，这可与荧光假单胞菌等进行鉴别。

?本菌对营养无特殊要求，在普通培养基上生长良好，在选择培养基和麦康凯琼脂、SS琼脂培养基上也能生长。

?在普通琼脂平板上经18-24小时培养，可形成圆形、边缘不整齐、扁平稍隆起、光滑温润且常呈融合状态的菌落。琼脂被染成蓝绿色或黄绿色。

?在血琼脂平板上经35℃

培养18-24小时，可形成大而扁平、湿润、有金属光泽、有特殊气味之灰绿色、蓝绿色的菌落，并形成透明溶血环。

生化特性

?氧化酶阳性，能氧化分解葡萄糖、木糖产酸，不产气，但产生红脓素或黑脓素的菌株，以及粘液型菌落的菌株可能不分解糖类。

?本菌能液化明胶，分解尿素，能利用枸橼酸盐，不产生吲哚，能还原硝酸盐为亚硝盐酸，或产生氮气。

（1）分离培养与鉴定：

标本可接种于血琼脂平板培养基和选择性培养基。鉴定根据镜下特征、菌落形态、生化反应等。

3.微生物检验（检验程序）

?血平板上毛玻璃样，金属光泽，生姜味

?可产生多种色素：

荧光素与绿脓素

（2）抗原检测：血清学分型、噬菌体分型。

（3）核酸检测：DNA内切酶分析、质粒指纹图谱分析、PCR指纹图谱分析、脉冲场凝胶电泳分析（PFGE）、基因芯片、PCR技术、16SrDNA鉴定技术等。

检验结果报告与分析

?诊断要与临床表现、标本来源相结合。

?初代敏感的菌株在治疗3~4天后可能发生耐药。因此治疗过程中，3~4天后重复药敏测试。

?粒细胞减少的的病人铜绿假单胞菌感染，要用最大剂量的抗菌药物。

?产粘液型铜绿假单胞菌所致感染治疗十分困难，应特别提示临床。

?产酶：金属酶，OXA酶。

?外膜蛋白的改变（为主要机制）：膜孔蛋白突变，阻止药物由外膜进入胞内。

?主动外排泵机制：对碳青霉烯类、喹诺酮类。

铜绿假单胞菌耐药机制

?两菌均人兽共患病原菌。

（马、驴、骡、猫、狗等）

?人类感染是经伤口、粘膜、呼吸道。

?急性患者可有高热、衰竭等全身症状。

?肺鼻疽病

、皮肤鼻疽病、内脏脓肿、菌血症、脓毒血症

。

临床意义

生物学特性

?革兰阴性杆菌

?无芽胞、无荚膜

?伪马勒鼻伯克霍尔德菌一端有丛鞭毛(1~4

根)，4℃不能生长

?马勒鼻伯克霍尔德菌无鞭毛无动力，42℃

不生长

?不产生绿脓素、荧光素。

微生物检验

?分离培养与鉴定

?需氧菌

?生长温度35℃

?普通培养基、血琼脂、麦康凯

?生化鉴定

?荧光直接法染色镜检，可快速诊断

?可存在于正常人皮肤、呼吸道、泌尿道。自然界分布广泛水、土壤、灰尘等。

?重要的条件致病菌。

?在非发酵菌的感染中，鲍曼不动杆菌仅次于铜绿假单胞菌，位列第二。

?近年呈明显上升趋势，尤其是泛耐药菌株的出现。第二节

不动杆菌属

生物学特性

?革兰阴性杆菌，多为球杆状或球状，常见成对排列染成阳性或阴阳不定，误认为球菌。

?无芽胞，无鞭毛。

?专性需氧菌。生长温度为35℃

?普通培养基，麦康凯、血平板均生长。

?氧化酶阴性，动力阴性，硝酸盐试验阴性。

微生物检验（检验程序）

血平板：菌落圆形、灰白色、光滑、边缘整齐、直径2~3mm，而洛菲不动杆菌菌落小，直径为1~1.5mm。

单凭生化反应鉴定十分困难，简易方法根据分解糖与否分为两大类。

能氧化分解葡萄糖、不溶血：鲍曼不动杆菌。

不氧化分解葡萄糖：

溶血：溶血不动杆菌。

不溶血：洛菲不动杆菌。

临床绝大多数是鲍曼不动杆菌，其余少见。

药物敏感试验及结果解释

?根据CLSI规定不动杆菌可以用Kirby-Bauer法做药敏试验。

?不动杆菌耐药性强。对全部氨基青霉素、一、二代头孢菌素和一代喹诺酮类抗生素天然耐药。

?可选用：SXT、TZP、CIP、LEV、DO、CT、MNO等。

?亚胺培南敏感性好，但容易快速形成耐药。

?替加环素（老虎素）

?嗜麦芽窄食单胞菌是重要的条件致病菌。

?呼吸道、泌尿道、伤口等部位感染，菌血症及心内膜炎。

?很常见：在不发酵菌引起的感染中，仅次于铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌，居临床分离阳性率的第三位。

第三节

嗜麦芽窄食单胞菌

生物学特性

?革兰阴性，端鞭毛，(1~8)根

?有动力、无芽胞、无荚膜

?生长温度为35℃，4℃不生长

?营养要求低，在血琼脂、普通培养基生长良好。

?菌落中等大小、圆形、光滑、湿润、产生不溶血的黄色色素或草绿色。有淡淡的氨味。

在血平板上孵育48小时以上，菌落中心有变透明的趋势，称之为“猫眼”现象

生化鉴定：

氧化酶阴性

有动力

液化明胶

水解七叶苷

赖氨酸脱羧酶阳性

氧化分解麦芽糖

氧化分解葡萄糖

氧化酶试验阴性、有动力的非发酵菌的生物学特性

菌

属

麦芽糖

赖氨酸

甘露醇

胆汁七叶苷

嗜麦芽窄食单胞菌

++－

－

洋葱伯克霍尔德

++++/－

唐菖蒲伯克霍尔德菌

－

－

+－

栖稻黄色单胞菌

+－

+－

浅黄金色单胞菌

+－

++少动鞘氨醇单胞菌

+

－

－

+药物敏感试验及结果解释

?治疗首选磺胺类：TMP/SMZ；喹诺酮类：环丙

氟派酸；替卡西林/棒酸

?亚胺培南(泰能)天然耐药。

?药敏试验纸片法仅有三种抗生素：左氧氟沙星、米诺环素、复方磺胺有折点。其他药敏试验应选用肉汤、琼脂稀释法作MIC，或采用E-TEST的方法。

军团菌属(Legionella)属于军团菌科，常见的与人类疾病有关的军团菌：

?嗜肺军团菌（Legionellapneumophila）

?米克戴德军团菌（L.micdadei）

?长滩军团菌（L.longbeachae）

?杜莫夫军团菌（L.dumoffii）

?波兹曼军团菌（L.bozemanii）

第四节

军团菌属

临床意义

?供水系统、中央空调、溶洞、雾化吸入等引起肺炎型和非肺炎型感染。

?肺炎型（重症）：嗜肺军团菌（LP），LP1、LP6所致。呼吸道症状、多脏器损害、头痛、畏寒、发热、消化道神经系统症状，致死率高。

?非肺炎型：病情较轻的自限性疾病。

?医院感染可高达23%

。

?慢性心、肺、肾病变、艾滋病或接受免疫抑制剂者

易发本病，且死亡率高达45%。

生物学特性

?革兰阴性杆菌

?菌体呈线状

?无芽胞，无荚膜，有端

鞭毛或侧鞭毛

?严格需氧

?触酶阳性

?可液化明胶

?不分解糖类

?部份菌株氧化酶阳性

微生物检验

?临床标本：痰、气管分泌物、胸水和血液为主。

?病理组织标本：必须制成悬液，再进行涂片和分离培养。

?环境污染标本：应先浓缩再接种。

微生物检验

分离培养：

?营养要求苛刻，生长缓慢

?生长温度为35℃

?最适pH6.7~7.0?初次分离必须采用(BCYE)?3~5天可形成1~2mm直径的光泽菌落

军团菌感染诊断试验比较

试验

敏感性(%)特异性(%)评注

培养

70100参考方法

直接免疫荧光

25～70>95不推荐常规应用

间接免疫荧光

70～90>99只用于嗜肺军团菌血清群1

酶标记免疫

70～90>99乳胶凝集

55～9085～99血清学（间接免疫荧光）

70～80>95辅助培养