10真菌与其他病原体的分子生物学检验课件

第十章真菌与其他病原体的分子生物学检验1真菌与其他病原体的分子生物学检验真菌的分子生物学检验衣原体的分子生物学检验支原体的分子生物学检验梅毒螺旋体的分子生物学检验原虫的分子生物学检验一、真菌的分子生物学检验白假丝酵母菌的分子生物学检验新型隐球菌的分子生物学检验真菌fungus广泛存在于自然界的真核细胞生物，具细胞核和细胞器不含叶绿素和其他光合作用的色素，以寄生和腐生方式获取营养有性繁殖，无性繁殖全世界有150万种，绝大多数对人类无害，少量(约300种)与人类疾病有关近年感染机会增加：光谱抗生素、激素、免疫抑制剂、抗癌药物使用器官移植，导管、插管技术开展艾滋病患者增多1、白假丝酵母菌的分子生物学检验基因组结构特征分子生物学检验技术临床意义白假丝酵母菌candidaalbican，又称白色念珠菌；一种条件致病菌广泛存在于自然界，也存在于正常人口腔、上呼吸道、肠道、阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病免疫功能低下的人群可引起相关疾病：皮肤念珠菌病，好发于皮肤皱褶处粘膜念珠菌病，以鹅口疮、口角炎、阴道炎最多见内脏及中枢神经念珠菌病，有肺炎、肠胃炎、心内膜炎、脑膜炎、脑炎等，偶发败血症传统检验方法：血培养耗时长，阳性率低组织活检：缺乏典型改变，影响诊断白假丝酵母菌的基因组结构特征二倍体，单倍体基因组长16Mb，8对染色体可产生染色体长度多态性现象染色体重排、易位、缺失个别染色体三倍体基因组中碱基转换/颠换的频率高达1/273，使菌体很好适应环境6419个ORF，其中5918个编码蛋白质功能基因包括：结构基因、形态相关基因、代谢相关基因、基因信息传递基因、致病基因、耐药基因编码：黏附素、生物膜、菌丝体的基因分子生物学检验技术PCRPCR-斑点杂交DNA指纹技术：RFLP,RAPD,电泳核型分析，AP-PCR测序芯片临床意义分子生物学检验技术简便，快速，灵敏，特异性高利于早期诊断用于菌株分类、分型，耐药基因检测2、新型隐球菌的分子生物学检验基因组结构特征分子生物学检验技术临床意义新型隐球菌cryptococcus，环境腐生菌，广泛存在于土壤、蔬菜、牛奶、草地、蜂巢、鸽粪中；人、动物主要传染源呈圆形或卵圆形，外裹由细胞壁和荚膜组成的被膜多由呼吸道吸入，另有经皮肤黏膜、消化道传染。可产生一种胞外磷脂酶B破坏肺泡中的表面活性物质，进而改变肺组织的物理特性，使菌体较易在肺内形成病灶，数月内经血行播散至脑或脑膜，引起炎症反应长期大量应用广谱抗生素、免疫抑制药、抗癌药物，接受器官移植术，白血病AIDS、淋巴肉瘤、系统性红斑狼疮、结核病、糖尿病等患者为主要易感人群

隐球菌性脑膜炎、脑膜脑炎

新型隐球菌分为两种：新生隐球菌：3个变种新生变种，格鲁比变种，2者的杂合体格特隐球菌根据细胞外荚膜多糖的抗原性差异，分为5种血清型：A、B、C、D、AD传统检测方法墨汁染色法真菌培养：“金标准”，阳性率不高血清学新型隐球菌的基因组结构特征单倍体，基因组约20Mb，14条染色体编码6574个基因2008年，陈江汉等人用PCR指纹技术，将129株新型隐球菌分为8个基因型VNI,VNII,---血清型AVNIII---血清型ADVNIV---血清型DVGI,VGII,VGIII---血清型BVGIV---血清型C分子生物学检验技术PCR：多扩增rDNA复合体斑点杂交PCR-RFLP：区分个体，确定个体间的遗传关系临床意义：特异性检测出新型隐球菌区别变种，不受治疗影响敏感性更高，可用于痰液、支气管和肺泡灌洗液的检测二、衣原体的分子生物学检验沙眼衣原体的分子生物学检验肺炎衣原体的分子生物学检验衣原体chlamydia，原核细胞型微生物，自然界广泛分布，专性活细胞内寄生，广泛寄生于人、哺乳动物、禽类，仅少数致病能通过0.2μm的滤器，无肽聚糖，对γ-干扰素敏感，基因组小，发育周期独特1、沙眼衣原体chlamydiatrachomatis(CT)人体内长期生存并广泛传播，不耐热主要寄生在黏膜细胞根据主要外膜蛋白的抗原分为18中血清型常规实验室检测分离培养或镜检衣原体包涵体，敏感可靠，但易受取材、培养条件、操作者经验影响血清学试验：简便，快速，但特异性差，易与金葡菌、链球菌、淋球菌等发生交叉反应沙眼衣原体的基因组结构特征同时含DNA和RNA具很强的DNA修复和重组系统，基因组与其他细菌及宿主细胞有广泛的遗传交换血清型D基因组约1.04Mb894个编码基因，其中4%编码基因与其他细菌有同源序列有1个7493bp隐蔽性质粒，与其他生物无同源序列分子生物学检验技术PCR：多扩增主要外膜蛋白基因、隐蔽性质粒DNA、16SrRNA基因LCR（连接酶链反应）技术DNA序列分析基因突变：质粒tetM基因(四环素耐药)23SrRNA基因(大环内酯类药物)核糖体蛋白基因L4gyrA基因（氟喹诺酮耐药）分子生物学检验的临床意义：方法简便、快速、敏感、特异适用于：无症状携带者检测、早期诊断、流行病学调查、基因分析、耐药检测2、肺炎衣原体chlamydiapneumoniae(CP)1989年确定，重要的人兽共患病原体人类感染很普遍，血清学证实50~90%的成年人CP抗体(+)呼吸道病原体，主要引起人非典型性肺炎，艾滋病、白血病等继发感染的重要病原菌之一常规实验室检验方法：病原体分离培养：方法负责，耗时，敏感性不高血清学检测：具良好的特异性、灵敏度，但机体产生抗体需几周时间，不适合早期诊断肺炎衣原体的基因组结构特征肺炎衣原体CWL-029株基因组双链环状DNA，1230kb，不含质粒，推测有1122个基因，编码基因1052个，结构RNA基因33个；186个基因在GenBank中未发现同源基因肺炎衣原体的分子生物学检验多用PCR技术检测肺炎衣原体，以种特异性抗原MOMP基因为靶序列普通PCRReal-timePCR巢式PCR竞争性PCR临床意义：早期诊断，流行病学调查，耐药性分析三、支原体的分子生物学检验肺炎支原体的分子生物学检验解脲支原体的分子生物学检验支原体mycoplasma，目前所知的能独立生活、自行繁殖的最小原核细胞微生物，不同于细胞，也不同于病毒种类繁多、分布广泛、造成危害大，涉及人、动物、植物及昆虫等，给人类健康和科研工作带来不利影响0.2~0.3μm大小，没有细胞壁，具可塑性、可过滤性、易溶解性；高度多形性基因组小，结构简单，生物合成、代谢能力有限，可在固体培养基上形成“荷包蛋”样菌落对人致病：肺炎支原体（肺炎），人型支原体，解脲支原体，生殖器支原体（泌尿生殖道感染）1、肺炎支原体mycoplasmapulmonis(MP)，原发性非典型性肺炎（肺炎支原体肺炎）的病原体主要经飞沫传染，潜伏期2～3周，发病率以青少年最高。临床症状较轻，或无症状，有个别死亡报道。一年四季均可发生，秋冬居多。MP的基因组结构特征MP基因组含能量代谢基因，DNA复制、转录、翻译必须的基因；维生素、核酸前体、脂肪酸合成的基因较少合成细胞壁、氨基酸的基因缺失肺炎支原体M129株单一环状dsDNA，816394bp677个ORF，39个RNA编码基因；75.9%ORF与其他生物有相似性肺炎支原体肺炎临床表现：影像学检查：胸片阴影显著，病变可很轻微，也可很广泛临床表现和胸部X线检查并不具特征性，要明确诊断，需要进行病原体的检测肺炎支原体病原学诊断支原体培养：标本：可为鼻咽拭子或吸液、痰、胸膜积液、支气管肺泡灌洗物、气管吸液和肺组织等培养：SP-4和改良的Hayflick肉汤和琼脂平板。一般在接种过后4~20天出现菌落缺点：肺炎支原体培养较为困难，需要特殊营养培养基，且生长速度较一般细菌慢许多，临床标本含量低，易污染，阳性率很低肺炎支原体病原学诊断免疫学检测：直接免疫荧光、免疫印迹、双单抗夹心酶免疫抗原捕获法MP与其他支原体有共同抗原，免疫学检测假阳性率高血清学检测：目前仍为国际上通用的诊断标准，急性感染血清学诊断应包括IgG和IgM抗体。在成人患者，IgM抗体阳性是急性感染的指标，但阴性不能排除支原体感染，此时IgM抗体可能缺失IgG抗体可用于回顾性诊断，对于肺炎支原体肺炎的早期诊断价值不大肺炎支原体分子生物学检测方法PCR,qPCR：几乎能检测所有已知的人类致病支原体，靶序列：16SrRNA基因可变区、保守区，P1蛋白基因区具有很高的敏感性和特异性，且检测方法快速、便捷但感染后肺炎支原体的持续存在、无症状的支原体携带都可能造成假阳性，其临床价值尚未完全确立其它：核酸杂交，PCR-RFLP，等临床意义：早期诊断，流行病学调查，耐药基因分析2、解脲支原体ureaplasmaurealyticum(UU)，脲原体属中唯一的1个种，因生长需要尿素而得名一类原核细胞微生物，体积介于细菌与病毒之间，是人类泌尿生殖道的常见病原体，与许多泌尿生殖道感染症、围产期感染和不育症等都有关系，性传播疾病的病原体之一。UU后，患者大多无明显症状，很难被患者觉察，也易造成漏诊菌落微小，直径仅15～25μm，须在低倍显微镜下观察，故旧称T株(tinystrain)。菌落表面有粗糙颗粒，在合适条件下可转成典型的荷包蛋样菌落生长需要胆固醇和尿素，分解尿素为其代谢特征，产生氨氮，使培养基pH上升，患者小便往往带有臊腥味解脲支原体基因组环状dsDNA,751719bp，GC含量低613个编码蛋白质的基因，39个编码RNA的基因；53%蛋白编码基因具生物学共，28%为假基因编码UU抗原的基因长约1200bp，N端1/3为保守区，包含群特异的抗原决定簇，C端2/3是由重复序列组成的可变区，包含型特异的抗原决定簇解脲支原体实验室检测形态学检查：Giemsa染色法将其染成淡紫色

支原体培养：“金标准”，但UU培养较难，用时长、操作复杂、敏感性低、特异性不高抗原检测：UU抗原是解脲支原体感染时被识别的主要外膜抗原，具有种特异性。报道方法有：用酶联免疫吸附试验、荧光标记抗体、肺炎支原体膜蛋白单克隆抗体、反向间接血凝法，直接检测分泌物和体液中支原体抗原，具有很高的特异度和灵敏度血清学方法：有支原体特异性血清学检测、支原体的非特异血清学方法，对支原体肺炎能起辅助诊断的作用，但检测特异性抗体的方法尚不能达到早期快速诊断的目的解脲衣原体Giemsa染色解脲支原体分子生物学检测方法PCR：简单、快速、特异、准确早期诊断鉴别诊断多种病原体的混合感染分型，耐药基因检测，流行病学研究核酸杂交，测序四、梅毒螺旋体分子生物学检验梅毒螺旋体的基因组结构特征梅毒螺旋体的分子生物学检验临床意义梅毒螺旋体是梅毒的病原体，因其透明，不易着色，故又称苍白螺旋体梅毒是一种广泛流行的性病。梅毒螺旋体只感染人类，通过性接触传染，或由胎盘传给胎儿，在胎儿内脏及组织中大量繁殖，可引起胎儿死亡或流产。单细胞原核生物，形态细长，5-15×0.1-0.2μm，弯曲成螺旋状电镜下显示其结构复杂，从外向内分为：外膜（主要由蛋白质、糖及类脂组成）、轴丝（主要由蛋白质组成）、圆柱形菌体（包括细胞壁、细胞膜及胞浆内容物）实验检查形态学：暗视野或墨汁显影，见运动活泼的密螺旋体即可诊断。方法简便，但重复性差。血清学检查非螺旋体抗原试验：用正常牛心肌的心类脂为抗原，检测病人血清中的反应素。反应素在第一期梅毒病变出现后1-2周就可测出，第二期阳性率几乎达100%，第三期阳性率较低。本试验所用抗原是非特异的，检测的抗体时应排除假阳性反应，结合病史，临床表现及多次的试验结果进行分析。螺旋体抗原试验：抗原为梅毒旋体，以检测血清中的特异性抗体，该试验特异性高。分子生物学检验：特异，敏感五、原虫的分子生物学检验弓形虫的分子生物学检验疟原虫的分子生物学检验溶组织内阿米巴的分子生物学检验原虫单细胞真核生物，整个虫体由一个细胞构成，具有生命活动的全部功能。体积微小，基本结构包括：胞膜、胞质及胞核。胞核内有染色质、核仁，富含DNA和RNA自然界分别广泛，医学原虫包括寄生在人体的腔道、体液、组织或细胞内的致病及非致病性原虫，约有40余种。有些原虫，如弓形虫、疟原虫、利什曼原虫、锥虫、溶组织内阿米巴，可对人体可造成严重危害。疟原虫疟原虫：人疟疾的病原体疟疾是一种严重危害人体健康的寄生虫病，全世界约1/2人口受威胁。疟原虫寄生于人及多种哺乳动物，少数寄生于鸟类和爬行类动物，已知有130余种；有严格的宿主选择性。疟原虫的基本结构：包括核、胞质和胞膜，环状体以后各期尚有消化分解血红蛋白后的最终产物—疟色素。血片经姬氏或瑞氏染液染色后，核呈紫红色，胞质为天蓝至深蓝色，疟色素呈棕黄色、棕褐色或黑褐色。除了疟原虫本身的形态特征不同之外，被寄生的红细胞在形态上也可发生变化。被寄生红细胞的形态有无变化以及变化的特点，对鉴别疟原虫种类很有帮助。

疟原虫的实验诊断1．病原学诊断厚、薄血膜染色镜检是目前最常用的方法。从外周血液中检出疟原虫是确诊的最可靠依据（经姬氏或瑞氏染液染色）2．免疫学诊断循环抗体检测：常用间接荧光抗体试验、间接血凝试验和酶联免疫吸附试验等。抗体在患者治愈后仍能持续一段时间，且广泛存在个体差异，检测抗体主要用于流行病学调查、防治效果评估及输血对象的筛选，在临床上仅作辅助诊断用。循环抗原检测：用血清学方法检测疟原虫的循环抗原能更好地说明受检对象是否有活动感染。常用放射免疫试验、抑制法酶联免疫吸附试验、夹心法酶联免疫吸附试验和快速免疫色谱测试卡等。疟原虫的实验诊断3．分子生物学技术PCR和核酸探针已用于疟疾的诊断，分子生物学检测技术的最突出的优点是对低原虫血症检出率较高。用核酸探针检测恶性疟原