现代生物技术在发酵工业中的应用已

第十二章现代生物技术在发 酵工业中的应用第一节概述第二节工程菌的发酵第三节动植物细胞的组织培养第四节固定化细胞发酵当前第1页\共有120页\编于星期四\9点第一节概述生物技术(biotechnology)，又称生物工程或生物工艺学等。它是近代发展非常迅速的一门综合性科学技术，涉及许多科学领域。生物技术是应用生物科学的理论、方法和技术，按照人们设计的蓝图，改良和加工生物或用生物及其制备物作为加工原料，提供所需的生物制品，为人类服务的综合性科学技术。当前第2页\共有120页\编于星期四\9点综合性科学技术知识密集型新产业应用领域很宽（农、工、食、药等）

当前第3页\共有120页\编于星期四\9点发酵工程是生物技术产业化的基础和关键技术，是生物技术四大支柱的核心，无论传统发酵产品，如抗生素、氨基酸等，还是现代基因工程产品，如疫苗、人体蛋白质等，都需要发酵技术进行生产。生物技术中，当前人们最感兴趣的是基因工程和细胞工程，它们是生物技术的主导领域，也是热点。发酵工程和酶工程等也是生物技术中的重要组成部分。这几方面的内容是相互联系和互相促进的。当前第4页\共有120页\编于星期四\9点1、工程菌的来源

基因工程菌：在生物体外对DNA分子进行重新组合，然后克隆到适合的宿主细胞，进行增殖和表达，所得到的重组菌株即是工程菌。2、生产用工程菌应具备条件①产品高浓度、高转化率和高产率；分泌型菌株最好；②能利用常用的碳源(如糖蜜、淀粉等)，并可进行连续培养；③菌株不致病，也不产生内毒素；④发酵所产生的热量和需氧量都低，发酵温度适当；⑤代谢控制容易进行；⑥重组DNA稳定，不易脱落。第二节工程菌的发酵一、工程菌的来源和应用当前第5页\共有120页\编于星期四\9点3、工程菌的应用蛋白类药物产品：如胰岛素、干扰素、生长激素等，还有几十种正在开发中。氨基酸生产：如高产的苏氨酸工程菌。维生素生产：能直接转化葡萄糖为2-酮基-L-古龙酸的工程菌，为维生素C生产开辟了新的途径。抗生素生产：如将头孢菌素生物合成的限制性扩环酶基因克隆到产生菌中，使头孢菌素C的产量提高了15％。当前第6页\共有120页\编于星期四\9点比较成熟的基因工程产品当前第7页\共有120页\编于星期四\9点

(一)基因重组细胞的种类原核：大肠杆菌和枯草杆菌真核：酵母菌和哺乳动物细胞等。

二、工程菌的培养当前第8页\共有120页\编于星期四\9点

(二)工程菌的培养

工程菌培养：类似于普通微生物的培养。另外要考虑：营养物质的浓度有毒代谢物质的排放导入基因的稳定性基因的转录效率、翻译产物向外分泌等因素。当前第9页\共有120页\编于星期四\9点1．培养装置重组大肠杆菌——通气搅拌罐实验室中以基础实验设备进行（一般采用通气搅拌发酵罐，如：大肠杆菌）；但操作要谨慎，防止工程菌株的外漏和扩散；中试试验必须要有良好的重复性，应用全自动的控制系统，减少接触，并且尽可能地获得大量的发酵参数。工程菌的培养装置既要防止外界微生物侵入罐内，污染杂菌，又必须不使重组体外漏。这是与沿用的通气搅拌式培养罐的区别所在。重组动物细胞——动物细胞培养装置(安瓿瓶)当前第10页\共有120页\编于星期四\9点2．培养基和高密度发酵

工程菌发酵有两条基本要求：使菌体生长良好，获得高浓度菌体(即高密度发酵)，才能得到最多的产物。

一般的微生物发酵菌体干重：大肠杆菌125g/L；酿酒酵母145g/L。基因工程菌更高，一般达到200g/L。其次，发酵用培养基尽可能的简单，以便分离产物。使用合成培养基，包括葡萄糖、铵盐和无机盐等。使用尽可能廉价的维生素或氨基酸的营养缺陷型的工程菌。当前第11页\共有120页\编于星期四\9点3．菌株和质粒的稳定性

工程菌中的质粒的稳定性（传代）和质粒内在的稳定性很重要。质粒保存率高，相应地就会得到高浓度的产物。可利用质粒带氨苄青霉素等抗生素抗性标记。目前多采用两个以上的抗生素抗性标记的质粒，带有这种质粒的菌株在药物的存在下能够生长，反之则菌株则不能够生长。利用这种选择性，还可以对工程菌遗传稳定性进行检测。

当前第12页\共有120页\编于星期四\9点

三、安全问题（一）重组DNA实验准则

准则主内容：物理密封（P1～P4）和生物学密封（B1和B2）物理密封：将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。（实验设备、实验室设计、试验注意事项）生物学密封：用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主（如维生素或氨基酸营养缺陷型），同时用不能转移至其它活细胞的载体，通过这样组合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外扩散。当前第13页\共有120页\编于星期四\9点重组菌株外漏的可能性主要有：机械密封；接种；排气；取样；放罐等。培养装置能够防止重组体外漏和杂菌的侵入，并且能够密闭灭菌；尾气排除要有除菌装置，如果有气溶胶产生必须要有收集气溶胶的设备；发酵后的下游工作必须在密闭设备或者安全柜内进行。工业生产中重组菌培养的设备标准（LS1，LS2）当前第14页\共有120页\编于星期四\9点

(二)防止基因重组菌外漏的措施

培养工程菌的外界条件至少要遵守物理密封(P1～P4)方法中的P1级规定。从生物安全性来考虑，常采用维生素或氨基酸营养缺陷型的工程菌。生产中，以下部分和操作均应采取一些措施，以防重组菌外漏：①排气；②机械密封；③取样；④培养后的灭菌；⑤接种；⑥放罐。

企业中进行重组菌培养的设备标准有LS-1和LS-2。当前第15页\共有120页\编于星期四\9点1.概念第三节动植物细胞的组织培养一、动物细胞培养动物细胞培养：将来自动物的某些器官或组织细胞，在模拟体内生理条件下进行体外培养使之存活和生长。（1975年后进入了新的阶段：基因工程细胞猴肾细胞产生生长激素1mg/d）。目前的单细胞状态培养早期的组织片培养当前第16页\共有120页\编于星期四\9点2.动物细胞培养生产的药物类型目前利用动物细胞生产的药物有5大类：1）病毒疫苗。如脊髓灰质炎、狂犬病、乙型肝炎等疫苗。2）免疫调节剂。如干扰素、白细胞介素、胸腺素、转移抑制因子等。3）激素。如绒毛促性腺素、生长激素、促红细胞生成素等。4）人体活性蛋白。如胰岛素、血纤维蛋白溶酶原。5）药用酶。尿激酶、天门冬酰胺酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。当前第17页\共有120页\编于星期四\9点动物胚胎幼龄动物器官细胞悬浮液10代细胞50代细胞原代培养传代培养（1）原代（初代）培养细胞：动物组织经过切碎、化学或酶处理得到的细胞，在培养期内（50代左右）其生长性状保持正常（一般20代左右的细胞可以作为种细胞冻存，生产疫苗、尿激酶和干扰素等）。3.动物细胞的性质（2）确立细胞株：原代培养的细胞经过反复分裂出现变异，能够在体外培养时无限制性得增殖，其形态遗传因子抗原性等都失去了原有的特性。当前第18页\共有120页\编于星期四\9点（3）移植继代培养：用酶液处理的贴壁附着细胞可以分散为单层细胞，继续培养又可形成贴壁细胞（细胞株）。成纤维细胞与确立细胞株继代培养的细胞，经过几代反复分裂为成纤维细胞，大部分不具有癌化性，保留原代培养细胞的特性；到分裂至50代左右分裂停止，继而死亡；此过程中少部分发生变异为确立细胞株。确立细胞株：有无限增殖的繁殖特性（遗传物质发生改变），大多数情况下可以进行大量悬浮培养，但具有癌化性质。当前第19页\共有120页\编于星期四\9点细胞来源：胚胎及成幼龄动物的组织器官单个细胞原代细胞细胞株细胞系剪碎胰蛋白酶分离细胞洗涤、稀释、分离原代培养传代培养遗传物质没有发生改变遗传物质发生改变当前第20页\共有120页\编于星期四\9点动物细胞培养当前第21页\共有120页\编于星期四\9点目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho（中华仓鼠卵巢）细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。当前第22页\共有120页\编于星期四\9点2.培养条件温度为37℃±0.5℃

pH接近中性6.8-7.6，，多数细胞对偏酸性的环境有耐受力；培养体系调节酸碱性利用CO2(NaHCO3)和细胞代谢产物组成的缓冲体系；气体：氧，二氧化碳，氮气；溶解氧的控制采用通气量和搅拌转速。目前常用的较多的是将硅氧管浸入培养液中，增加气液接触面。营养条件需要多种氨基酸，维生素，辅酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生长因子，其中多种成分可以由血清提供。当前第23页\共有120页\编于星期四\9点1)实验室仪器和设备：常规的细胞培养设备：如CO2孵箱；培养器材：如培养瓶，纯水设备，干燥消毒除菌设备，清洗设备等。2)培养液：目前常用的基础培养液均已商品化，如RPMI1640，MEM，DMEM，F12等，可根据培养需求合理选择。当前第24页\共有120页\编于星期四\9点细胞培养转瓶培养机当前第25页\共有120页\编于星期四\9点3)血清：一般常用为小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它动物血清。由于不同的研究目的，血清成分往往干扰研究实验，如进行药物和受体及营养等方面的研究时，需要使用无血清培养基。一、动物细胞培养当前第26页\共有120页\编于星期四\9点4)平衡盐溶液：主要用于作为稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压，提供缓冲系统，使培养液的酸碱度维持在培养细胞生理范围内，提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。常用的有PBS，Hank’s等。5)抗生素：常用为青霉素（每毫升培养液50~100单位）和链霉素（每毫升培养液50~100微克）。一、动物细胞培养当前第27页\共有120页\编于星期四\9点6)其它添加成分：缓冲系统，常用为HEPES，缓冲效能(pKa)在20℃时为7.55，37℃为7.31；HEPES不是起维持pH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速pH变化的，所以调整pH常常用NaHCO3溶液。有机补充物，如丙酮酸钠，谷胺酰氨等。促细胞分裂因子，如生长因子类的FGF(成纤维细胞生长因子)，EGF(表皮生长因子)。贴壁和铺展因子，如胶原蛋白，纤粘蛋白等。可根据培养细胞的特殊要求进行添加。一、动物细胞培养当前第28页\共有120页\编于星期四\9点3.动物细胞培养特性除单细胞原生动物外，细胞培养过程具有以下特性：①细胞生长缓慢，易受微生物污染，培养时需用抗生素；②动物细胞较微生物大得多．无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差；③培养过程需氧量少，且不耐受强力通风与搅拌形成的较大流体剪切力；④在培养中，细胞相互粘连以集群形式存在，培养过程具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性及功能全能性；⑤产物分布于细胞内外，生产成本较高，但产品价格昂贵；⑥大规模培养时，不可照用微生物反应的经验；⑦原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡。当前第29页\共有120页\编于星期四\9点4.动物细胞大规模培养的主要方法

依细胞种类：原代培养传代培养依培养容器和方式：静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养中空纤维培养、固定床或流化床培养依培养基：液体培养固体培养从生产实际分为：悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养当前第30页\共有120页\编于星期四\9点4.动物细胞大规模培养的主要方法(1)贴壁培养是必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。适用于一切贴壁依赖性细胞，也适用于兼性贴壁细胞。圆形的细胞一经贴壁就迅速铺展呈多种形态。此后细胞就开始有丝分裂并很快进入对数生长期。一般在数天后就铺满生长表面，形成致密的单层细胞。这种培养的方法又叫单层细胞培养。接触抑制：贴壁生长的细胞，当每个细胞与其周围的细胞互相接触时，细胞就停止增殖，长成单层的细胞。须在重新分散后，分瓶继续培养，才能继续分裂增殖，这叫传代。当前第31页\共有120页\编于星期四\9点几个概念贴壁依赖性细胞：需要有适量带电荷的固体或半固体支持表面才能生长的细胞。大多数动物细胞都属于此类。非贴壁依赖性细胞：不依赖于固体支持物表面生长的细胞，可在培养液中悬浮生长，被称为悬浮细胞。举例：血液、淋巴细胞、肿瘤细胞和某些转化细胞，Namalwa细胞。兼性贴壁依赖性细胞：对支持物的依赖性不严格，既可贴壁生长，也可悬浮生长。举例：CHO细胞、BHK细胞、L929细胞。理想的药物生产细胞系当前第32页\共有120页\编于星期四\9点贴壁培养的优点：

●容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。

●容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。

●当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品。

●同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。

●适用于所有类型细胞。当前第33页\共有120页\编于星期四\9点贴壁培养的缺点：操作麻烦，传代或扩大培养时需先消化，培养条件不易均一，传质和传氧较差。与悬浮培养法相比

●扩大培养比较困难，投资大；

●占地面积大；

●不能有效监测细胞的生长；

当前第34页\共有120页\编于星期四\9点细胞贴壁的表面：要求具有净阳电荷和高度表面活性。对微载体而言还要求具一定电荷密度；若为有机物表面，必须具有亲水性，并带阳电荷。贴壁培养系统：主要有转瓶、中空纤维（后面专题介绍）、玻璃珠、微载体系统（后面介绍）等。

当前第35页\共有120页\编于星期四\9点当前第36页\共有120页\编于星期四\9点转瓶培养系统：培养贴壁依赖型细胞最初采用转瓶系统培养。转瓶培养一般用于小量培养到大规模培养的过渡阶段，或作为生物反应器接种细胞准备的一条途径。细胞接种在旋转的圆筒形培养器-转瓶中，培养过程中转瓶不断旋转，使细胞交替接触培养液和空气，从而提供较好的传质和传热条件。

优点：结构简单，投资少，技术成熟，重复性好，放大只需简单的增加转瓶数量等。

缺点：劳动强度大，占地空间大，单位体积提供细胞生长的表面积小，细胞生长密度低，培养时监测和控制环境条件受到限制等。

当前第37页\共有120页\编于星期四\9点反应器贴壁培养：此种培养方式中，细胞贴附于固定的表面生长，不因为搅拌而跟随培养液一起流动，因此比较容易更换培养液，不需要特殊的分离细胞和培养液的设备，可以采用灌流培养获得高细胞密度，能有效地获得一种产品；但扩大规模较难，不能直接监控细胞的生长情况，故多用于制备用量较小、价值高的生物药品。当前第38页\共有120页\编于星期四\9点(2)悬浮培养让细胞自由地悬浮于培养基内生长繁殖。适用于一切种类的非贴壁依赖性细胞（悬浮细胞），也适用于兼性贴壁细胞。由于动物细胞的特点，其培养方式在许多方面与经典发酵不同。小规模：转瓶和滚瓶培养，大规模：发酵罐式的细胞培养反应器。悬浮培养的关键是要选择适当的搅拌和通气装置。悬浮培养，设备结构简单，有成熟的理论计算，可以借鉴微生物发酵的部分经验，放大效应小。但是悬浮培养的细胞密度较低，当前第39页\共有120页\编于星期四\9点优点：操作简便，培养条件比较单一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模，在培养设备的设计和实际操作中可借鉴细菌发酵的经验；可连续收集部分细胞进行移植继代培养，传代时无需消化分散，免遭酶类、EDTA及机械损害；细胞收率高，并可连续测定细胞浓度，还有可能实现大规模直接克隆培养。缺点：细胞体积较小，较难采用灌流培养，细胞密度较低。转化细胞悬浮培养有潜在致癌危险。当前第40页\共有120页\编于星期四\9点无血清悬浮培养是用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清的一种细胞培养方式，它能减少后期纯化工作，提高产品质量，正逐渐成为动物细胞大规模培养的研究新方向。当前第41页\共有120页\编于星期四\9点(3)微载体培养系统微载体是直径为60～250μm的微珠（如葡聚糖Cytodex1微载体）。动物细胞贴壁于微载体上生长，微载体悬浮于培养基中，细胞在微载体表面逐渐生长成单层的培养方法，或称微珠培养法。此方法把单层培养和悬浮培养的优点融汇在一起。制备微载体的材料主要有：

葡聚糖明胶玻璃纤维素等当前第42页\共有120页\编于星期四\9点1967年，VanWezel开发了微载体系统培养贴壁细胞。微载体是直径60-250μm的微珠。多用带不同基团的葡聚糖交联成几种大分子，使其带有适当电荷或介质，以利于细胞的贴壁及生长。

例如：葡聚糖Cytodex1微载体大小60~87μm

，在培养液中膨胀160~230μm，每微克表面积0.6m2，相当于7个标准的旋转瓶。（β-干扰素）当前第43页\共有120页\编于星期四\9点理想微载体需具备的条件微载体表面性质与细胞有良好的相容性；微载体的材料无毒性；微载体的材料是惰性材料；材料比重为1.030-1.045g/ml；粒径60-250µm（溶胀后），大小均一；具有好的光学透明性；基质的性质是软性的；可耐120℃高温，便于采用高压蒸汽灭菌原料充分，制作简便，价格低廉，可反复使用当前第44页\共有120页\编于星期四\9点当前第45页\共有120页\编于星期四\9点与微载体结合的生物反应器系统当前第46页\共有120页\编于星期四\9点当前第47页\共有120页\编于星期四\9点优点：1)表面积／体积比大；2)把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点；3)培养基利用率高；4)简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，采样重演性好；5)可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况；6)收获过程不复杂；7)放大较容易；8)劳动强度小；9)培养系统占地面积和空间小。当前第48页\共有120页\编于星期四\9点(4)固定化培养概念：用物理、化学方法将细胞固定在载体介质上，然后进行悬浮培养。应用：贴壁依赖性和非贴壁依赖性细胞。优点：细胞密度高、抗剪切力和污染，生产首选方法：共价交联：双功能试剂处理，细胞之间交联。吸附：物理吸附使细胞贴附在固体载体表面。包埋：细胞包埋在载体内部。微囊法：亲水半透膜把细胞包埋在微囊内。当前第49页\共有120页\编于星期四\9点生物反应器必备条件制造生物反应器所采用的一切材料，尤其是与培养基、细胞直接接触的材料，对细胞必须是无毒性的生物反应器的结构必须使之具有良好的传质、传热和混合的性能密封性能良好，可避免一切外来的不需要的微生物的污染对培养环境中多种物理化学参数能自动检测和调节控制，控制的精确度高，能保持环境质量的均一(1)动物细胞生物反应器的类型5.动物细胞培养的设备与技术当前第50页\共有120页\编于星期四\9点可长期连续运转容器加工制造时要求内面光滑，无死角，以减少细胞或微生物的沉积拆装、连接和清洁方便，耐高压蒸汽消毒，便于操作维修设备成本尽可能低生物反应器必备条件当前第51页\共有120页\编于星期四\9点按规模大小可分为：实验室规模：＜20L，用于培养工艺的研究;中试规模：20~100L，提供一定量的产品，供纯化、临床前的各种检测和临床观察，也包括进一步的工艺优化实验;生产规模：＞100L，用于生产，提供产品。当前第52页\共有120页\编于星期四\9点搅拌罐式生物反应器气升式生物反应器透析袋或膜式生物反应器中空纤维生物反应器固定床或流化床式生物反应器类型：当前第53页\共有120页\编于星期四\9点机械搅拌式生物反应器当前第54页\共有120页\编于星期四\9点罐培养的技术要点1、培养装置和培养系统：基本上与微生物相似，但有些特殊要求。①搅拌桨叶的形状（海轮或倾斜叶片）和搅拌转速（40－50rpm

）要有特殊设计。②培养系统必须保持长期无菌状态（系统密封性；抗生素）。③培养罐、配管的材质必须要对培养的细胞无毒害作用（通常采用不锈钢）。2、培养条件的控制：可采用分批、流加、半连续和连续，微载体培养只能用分批培养法；培养温度、溶解氧、pH、罐压、搅拌转速等也要控制，而且控制的精确度要更高。当前第55页\共有120页\编于星期四\9点气升式生物反应器当前第56页\共有120页\编于星期四\9点其中关键的是一个笼式撑拌器。笼式通气装置的特点主要是可以避免在向培养基中通气时，气泡直接损伤细胞（因为气泡已被上部的200目丝网机械地破坏了。气腔式反应器（悬浮培养或微载体培养用）当前第57页\共有120页\编于星期四\9点

与搅拌式生物反应器相比，具有剪切力小，混合均一，氧和营养的传递好，由于没有了机械搅拌的结构，有利于设备的密封，降低了造价。高径比一般在10：1左右。当前第58页\共有120页\编于星期四\9点中空纤维反应器当前第59页\共有120页\编于星期四\9点中空纤维反应器：左右两箭头为无菌空气进出口。细胞生长在由半透性的多孔膜制成的中空纤维的外表面。中空纤维培养系统当前第60页\共有120页\编于星期四\9点由数百乃至数千根中空纤维集束组成的反应器，纤维的材料为聚砜或丙烯共聚物，纤维壁厚为50-100m，呈多孔性，内层为超滤膜，内腔直径为200m，两端用环氧树脂等材料将纤维粘和在一起，并使内腔开口于外加的塑料圆筒，使形成两个隔开的腔。①不能重复使用；②不能耐受高压灭菌，需用环氧乙烷或其它消毒剂灭菌；③难以取样检测。当前第61页\共有120页\编于星期四\9点在中空纤维生物反应器中就形成了两个空间：一是“内室”，即纤维管内空间，可灌流无血清培养液供细胞生长；二是“外室”，即纤维管与管之间的间隙；细胞接种到外室，细胞贴附在外室的管壁上，并迅速吸取从内室渗透出来的养分，迅速生长繁殖。当前第62页\共有120页\编于星期四\9点膜式生物反应器当前第63页\共有120页\编于星期四\9点在动物细胞培养过程中，会产生一些代谢产物，如乳酸和氨等，对细胞的生长和产物的产生会产生抑制作用，因此有些学者设计了透析袋或膜式反应器，它们可将这些有害代谢产物透析或过滤掉，从而使细胞生长至更高密度，同时可根据需要选用不同相对分子质量的膜，使产物保留在膜内或与细胞分离开。当前第64页\共有120页\编于星期四\9点当前第65页\共有120页\编于星期四\9点结构较简单，装填的材料可以是一切对细胞无毒、又有利于细胞贴附的材料，有实心载体和有孔载体两类。当前第66页\共有120页\编于星期四\9点Wave摇袋式细胞培养生物反应器当前第67页\共有120页\编于星期四\9点当前第68页\共有120页\编于星期四\9点当前第69页\共有120页\编于星期四\9点当前第70页\共有120页\编于星期四\9点（2）动物细胞培养的操作方式分批式操作补料-分批（或流加式）操作（细菌生产中常用）半连续式操作连续式操作（个别情况下用于悬浮细胞的培养）灌流式操作当前第71页\共有120页\编于星期四\9点灌流式操作定义：当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。但细胞留在反应器内，使细胞处于一种不断的营养状态。当前第72页\共有120页\编于星期四\9点细胞可处在较稳定的良好的环境中，营养条件好，有害代谢废物浓度低；可极大地提高细胞密度，从而极大地提高了产品产量；产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温下保存，有利于产品质量的提高；培养基的比消耗率较低，加之产量质量的提高，生产成本明显降低。灌流式操作的优点当前第73页\共有120页\编于星期四\9点动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等（3）大规模动物细胞培养的问题及对策

①优化细胞培养环境②改变细胞特性③提高产品的产率当前第74页\共有120页\编于星期四\9点①细胞培养环境细胞培养环境中抑制因素的积聚是提高细胞密度的主要限制因素。体外动物细胞培养中氨离子的积累是抑制细胞生长的主要因素之一。氨的积聚使细胞内UDP氨基己糖(UDP-N-乙酰葡糖胺和UDP-N-乙酰半乳糖胺)增加，影响细胞的生长及蛋白的糖基化过程。当前第75页\共有120页\编于星期四\9点②细胞死亡与凋亡

最近研究显示在大规模培养生物反应器中细胞的死亡中80%是凋亡所导致，而不是以前所认为的坏死。而在大规模细胞培养中，细胞死亡是维持细胞高活性和高密度的最大障碍。细胞凋亡/死亡多是在营养成分耗尽、有毒代谢产物增多时发生。因此，理论上讲，防止或延长细胞死亡或使其处于一种“细胞静止”过程可以有效降低营养成分消耗和代谢毒物产生，有利于提高细胞的培养密度、延长细胞的培养周期，从而提高目标产品的产量。当前第76页\共有120页\编于星期四\9点a）营养物质抗凋亡

在常规生物反应器构造中，营养耗竭或缺乏培养基中特殊的生长因子则引起凋亡，例如血清，糖或特殊氨基酸的耗尽。培养基中添加氨基酸或其它关键营养可抑制凋亡、延长培养时间从而提高产品的生产。大规模培养中细胞凋亡主要由于营养物质的耗竭或代谢产物的堆积引起，如谷氨酰胺的耗竭是最常见的凋亡原因，而且凋亡一旦发生，补加谷氨酰胺已不能逆转凋亡。另外，动物细胞在无血清、无蛋白培养基中进行培养时，细胞变得更为脆弱，更容易发生凋亡。当前第77页\共有120页\编于星期四\9点b）基因抗凋亡

与凋亡相关的一系列基因产物可对其进行正、负向的调控，因此可通过导入相应基因来调节细胞凋亡的机制。Bcl-2基因是目前最为有效的抗凋亡基因，在多种细胞系中均表现出很强的抗凋亡活性。此外，向CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）中导入p21、p27的基因，使细胞周期中G1期延长（细胞静止），改造后，细胞活力正常，外源基因表达蛋白量提高。其优点是产品成本降低，产量提高，遗传一致性高。

当前第78页\共有120页\编于星期四\9点c）化学方法抗凋亡

凋亡发生时细胞许多部位发生生化物质的改变，有些变化如改变细胞氧化还原条件产生活性氧在凋亡信号阶段发生，其它的如破坏线粒体膜电位、激活caspase则发生在凋亡效应阶段，这在绝大多数细胞死亡中是相同的。因此，阻止这些生化物质的改变可能阻止或至少延迟细胞凋亡的发生，运用化学物质可抑制信号效应阶段的发生，被认为是抗调亡策略之一。当前第79页\共有120页\编于星期四\9点③培养基与细胞系无血清培养基成为当今细胞培养领域研究的一大课题。无血清培养基的优势在于避免了血清的批次、质量、成分等对细胞培养造成的污染、毒性作用和不利于产品纯化等不良影响。在生产疫苗、单抗和各种生物活性蛋白等生物制品的应用领域中，优化无血清培养基的成分可使不同的细胞在最有利于细胞生长和表达目的产物的环境中维持高密度培养。但无血清培养基并不适用于广泛的细胞类型，不同类型的细胞甚至不同的细胞系或细胞株都有可能有各自的无血清培养基构成。当前第80页\共有120页\编于星期四\9点④过程监控大规模动物细胞培养中由于大量细胞的代谢，细胞培养环境迅速改变，在线过程监控更为重要。当前第81页\共有120页\编于星期四\9点第三节动植物细胞的组织培养二、植物组织细胞培养组织培养：将植物的部分组织和器官切下，进行表面消毒杀菌，在一定培养基中进行培养，用于获得种苗、新的组织和器官或者生产生物药物。目前，组织培养技术已经进行的生产：珍惜植物愈伤组织幼苗；生物碱；皂甙；色素等等，植物的次级代谢物优点：不受气候影响；可以人工控制，目的产物的获取有针对性；可以进行定向的生物转化植物组织培养主要用于珍惜植物种苗的繁殖和次生代谢产物的获得。当前第82页\共有120页\编于星期四\9点①人为控制条件，克服人工栽培的不足；②不受季节气候的影响，不需占用大量耕地；③可以排除病虫害的侵扰；④可以进行特定的生物转化，克服化学合成的缺点。用植物组织培养进行生产优点：当前第83页\共有120页\编于星期四\9点植物细胞培养的特性：1.植物细胞较微生物细胞大得多，有纤维素细胞壁。细胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差；2.培养过程生长速度缓慢，易受微生物污染，需用抗生素；3.细胞生长的中期及对数期，易凝聚为直径达0.4mm的团块，悬浮培养较难；4.培养时需供氧，培养液粘度大，能耐受通风搅拌；当前第84页\共有120页\编于星期四\9点植物细胞培养的特性：5.具有群体效应、无锚地依赖性及接触抑制性；6.因为有细胞壁，培养细胞产物滞留于细胞内，产量较低；7.细胞培养过程具有结构与功能全能性，因而易分化，从而导致目的产物低于原植物体内的浓度；8.悬浮培养中要求有一定的细胞浓度，否则不生长（25000～50000个/mL）。

当前第85页\共有120页\编于星期四\9点植物细胞培养流程一般为：细胞株的建立：愈伤组织的培养，分离出单细胞的优良无性繁殖体系经摇瓶获得种子，扩大种子培养放大培养当前第86页\共有120页\编于星期四\9点当前第87页\共有120页\编于星期四\9点紫草宁细胞培养效果进行愈伤组织的培养，并将从愈伤组织中分离出单细胞，进行优良的细胞株选择，建立无性繁殖细胞系，经培养获得的游离细胞扩大培养作为种子供大规模发酵使用。目前采用植物细胞培养技术进行的植物次级代谢产物的生产，其产量都高于原来植物体中的代谢物含量，如：小檗碱，冬虫夏草，紫草素等。当前第88页\共有120页\编于星期四\9点一般的植物细胞培养采用深层液体培养，营养成分除了碳氮源，无机盐以外，还包括各种生长因子（维生素）和植物生长调节剂（随生产产物的不同而改变）（烟草细胞培养基RM-1962）由于植物细胞的特殊性质，振荡或搅拌培养时需要控制特定的转速和培养温度：振荡培养振荡频率100左右偏心距4cm左右；搅拌转速100rpm以下；培养温度都在30℃以下（对于愈伤组织和细胞培养的温度，应视不同植物来源而不同）。培养条件当前第89页\共有120页\编于星期四\9点植物细胞培养需要解决的问题及基本方法问题包括：①氧和二氧化碳的控制，过多氧过少氧均不利于生长；②营养物的供应，同动物细胞；③细胞密度过高引起细胞团聚甚至分化；④培养过程中细胞的分化的防止；⑤细胞取得中微生物的去除；⑥细胞壁脆性的存在要求培养体系剪切力要小。基本工艺同样可分为：分批培养，半连续培养，连续培养（恒化培养）和固定化培养。培养反应器可分为通气搅拌式、鼓泡式、气升式等。实验室小规模可用摇瓶、平板、微室等。当前第90页\共有120页\编于星期四\9点工艺过程例当前第91页\共有120页\编于星期四\9点第四节固定化细胞发酵一、概述细胞固定化技术-----是酶固定化技术的延伸，固定化细胞可称为第二代固定化酶。方法：吸附、交联、共价结合、包埋固定化酶-----是被固定在某一有限空间内不再能自由流动而仍有催化活性的酶。固定化酶优点：不溶于水，易于与产物分离；可反复使用；可连续化生产；稳定性好。固定化酶缺点：固定化过程中往往会引起酶的失活。当前第92页\共有120页\编于星期四\9点固定化细胞与固定化酶相比，具有以下优点①可以免除酶的提取和精制；②固定化细胞系统对外界条件(如pH)变化的敏感性不强，故有利于控制反应；③允许有高负荷的载体，而载有固定化酶的载体，由于蛋白-蛋白之间的相互作用，可使酶活下降；④如果反应系统需要许多酶和辅因子再生，固定化细胞则更适合。

当前第93页\共有120页\编于星期四\9点固定化技术1.吸附法①物理吸附②离子吸附2.包埋法①格子型包埋②微胶囊型包埋3.通过双功能试剂进行共价交联4.和水不溶性载体共价结合包埋法具有使用的普遍性，主要包埋剂有：海藻酸钠－CaCl2，琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，卡拉胶等；微胶囊法：采用半透膜包裹细胞。当前第94页\共有120页\编于星期四\9点包埋法：将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞的方法。优点：步骤简单，条件温和，负荷量大，细胞泄露少，抗机械剪切。当前第95页\共有120页\编于星期四\9点包埋法缺点：扩散限制，并非所有的细胞处于最佳基质浓度，且大分子基质不能渗透到高聚物网络内部。一般适用于非贴壁依赖性细胞的固定。常用的载体：琼脂糖；海藻酸钙凝胶当前第96页\共有120页\编于星期四\9点取0.6ｇ海藻酸钠溶于25ml无菌水,加热溶解后,冷却，静置1h消泡；取5ml菌悬液摇匀倒入，再加无菌水30ml使海藻酸钠的最终浓度2%,将海藻酸钠与5ml菌悬液混合匀；用5ml注射器滴入100ml4%CaCl2溶液中,交联固定12h。滤出固定化颗粒用生理盐水洗净。海藻酸钠包埋法当前第97页\共有120页\编于星期四\9点琼脂凝胶包埋法称取1.5ｇ琼脂溶于25ml水中，加热溶解后加无菌水至25ml混匀,冷却到55℃,将5ml菌悬液摇匀倒入混合均匀,立即将琼脂与聚磷菌的混合物倒入无菌培养皿中,过夜，然后切成3×3×3mm的小方块，用生理盐水洗净。当前第98页\共有120页\编于星期四\9点微囊法：用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微囊内，细胞不能溢出，但小分子物质及营养物质可自由出入半透膜。囊内是微小培养环境，与液体培养相似，能保护细胞少受损伤，故细胞生长好、密度高。当前第99页\共有120页\编于星期四\9点

微囊法在动物细胞微囊化的制备中，主要是应用海藻酸—聚氨基酸的方法:动物细胞与海藻酸钠溶液混合搅拌，经过微囊发生器将微球滴入氯化钙溶液中。海藻酸钙不溶于水，形成凝胶，然后再用聚氨基酸处理，使微球表面成膜，最后用柠檬酸处理去除微球内的钙离子，使球内的海藻酸成液态，动物细胞得以悬浮在其中。海藻酸和聚氨基酸是关键材料。当前第100页\共有120页\编于星期四\9点细胞悬浮液海藻酸钠溶液海藻酸钙凝胶动物细胞CaCl2溶液微囊发生器

聚赖氨酸柠檬酸纳溶液

微囊(动物细胞)具膜微囊溶液动物细胞膜动物细胞微囊的制备过程示意图当前第101页\共有120页\编于星期四\9点聚赖氨酸和壳聚糖聚赖氨酸：在以海藻酸钠为基质的微胶囊研究中几乎都采用它制备囊膜，但是聚赖氨酸价格十分昂贵(300～400$/g)。壳聚糖(CS)：源于甲壳素，含大量伯氨基。能与海藻酸钠等阴离子聚电解质反应成膜，可作为聚赖氨酸的替代物。当前第102页\共有120页\编于星期四\9点微囊直径控制在200-400μm为宜。制备中应注意：

●温和、快速、不损伤细胞，尽量在液体和生理条件下操作；

●所用试剂和膜材料对细胞无毒害；

●膜的孔径可控制，必须使营养物和代谢物自由通过；

●膜应有足够机械强度抵抗培养中搅拌。

当前第103页\共有120页\编于星期四\9点使用固定化细胞发酵的优点：①分批发酵可用固定化细胞进行连续反应来代替；②可以利用高密度的固定化细胞集合体进行发酵，反应效率大大提高；③可以人为地控制固定化细胞的生理状态，因为许多代谢产物(或酶)仅仅在细胞的静止期才能形成，所以有利于产物的形成。发酵液的体积也大大减小。当前第104页\共有120页\编于星期四\9点二、理想的固定化细胞制备方法的特点①能够控制固定化细胞的大小和孔隙度；②固定化所使用的原料应该便宜、易得，成本应尽量低；③固定化方法简便、易行，过程温和，尽量少损伤细胞；④具有稳定网状结构，在所使用的pH和温度下，不会被破坏；⑤固定化细胞应具有良好的机械稳定性和化学稳定性；⑥所用载体，对细胞应该是惰性的，即不损伤细胞；⑦底物、产物和其他代谢产物能够自由扩散，降低产物和其他代谢产物对细胞酶反应的抑制；⑧单位体积的固定化细胞应该拥有尽可能多的细胞，当使用固定化活细胞时，更有此需要。

当前第105页\共有120页\编于星期四\9点固定化细胞有3种不同的生理状态：①固定化后是死细胞，这种状态只适用于一种酶催化的反应；②固定化后的细胞生活力不确定，这种状态通常用于一种酶或少数几种酶所催化的反应；③固定化后是活细胞，这种状态适用于多酶反应，特别是需要辅酶的反应。

当前第106页\共有120页\编于星期四\9点当前第107页\共有120页\编于星期四\9点三、固定化生物反应器按其用途可分为三类：①生物转化反应器，多用于死细胞或不再生长繁殖的细胞。不供氧，不排CO2；②产物的生成与细胞的生长无关的生物反应器，适用于处在生长状态的细胞，有利于细胞的生长和产生次级代谢产物，需或不需供氧，但须供给维持细胞生理活动和合成产物所需要的营养物；③生产初级代谢产物的反应器，必须符合细胞生长的需要并供给充足的营养物，良好通气，并排出生成的CO2，须控制细胞的浓度，以便在恒定的条件下进行操作。

当前第108页\共有120页\编于星期四\9点三、固定化生物反应器现有的常用固定化细胞生物反应器有：连续搅拌罐反应器、填充床反应器、流化床反应器、膜反应器、转盘式生物反应器和其他类型反应器等。当前第109页\共有120页\编于星期四\9点固定化细胞膜反应器最常用的膜反应器是中空纤维和螺线式卷绕反应器。在中空纤维反应器中，细胞既可处于纤维管中，又可处于管外，螺线式卷绕膜反应器实质上是卷成圆筒形的平板反应器。当前第110页\共有120页\编于星期四\9点固定化细胞膜反应器当前第111页\共有120页\编于星期四\9点膜反应器膜反应器的优点是可以重复使用。因此，尽管投资放大，重复使用使这种形式的固定化反应器比较经济。当前第112页\共有120页\编于星期四\9点（1）

aa的生产：L－天冬氨酸（具有高活性酶的大肠肝菌）6.固定化细胞的应用（2）抗生素的生产：6-氨基青霉烷酸（6－APA）青霉素酰化酶当前第113页\共有120页\编于星期四\9点（3）活性蛋白药物的生产：主要由动物固定化细胞进行生产，包括单抗，干扰素，白介素，生长因子等。目前利用基因工程技术构建工程菌可以进行小型连