生化与分子生物学研究思路与技术陈汉春课件

生物化学:研究活细胞及有机体内各种分子及其相互间化学反应的科学。研究活细胞的化学组成及相互反应和进程的科学，即“生命的化学”。生命科学的基础语言，即研究生命的分子基础(molecularbasisoflife)。1当前第1页\共有89页\编于星期四\19点一.生物化学研究的目的：从分子水平了解活细胞相关的所有化学进程。对健康、营养的理解和维持以及对疾病的发生机理的阐明和有效治疗。2当前第2页\共有89页\编于星期四\19点二.生物化学的研究对象：研究生物分子的组成成分如碳、氢、氧、氮、磷等化学元素以及水和无机盐代谢。研究生物大分子如DNA、RNA、蛋白质、多糖及脂类的结构、功能、结构与功能的关系以及这些生物大分子的代谢和相互作用。3当前第3页\共有89页\编于星期四\19点三.生物化学研究的发展：

生物化学研究历经两百多年进入分子生物学年代，走过了三个发展阶段：

叙述生物化学阶段动态生物化学阶段功能或分子生物化学阶段

4当前第4页\共有89页\编于星期四\19点叙述生物化学(descriptive

biochemistry)阶段(1770～1903)

又称为静态或形态生物化学(staticormorphologicalbiochemistry)。研究生物体内主要化学物质的组成；分离出各种氨基酸、脂酸、甘油、糖类、柠檬酸、乳酸和苹果酸；从肝中分离出糖元；发现了核质（nuclein）及核酸；奠定了酶学基础理论。5当前第5页\共有89页\编于星期四\19点我国人民在公元前二十一世纪，已用曲酿酒，称曲为酒母，又叫做酶；公元前十二世纪，已将豆、谷发酵，捣烂、加盐以造酱，并制出麦芽糖，当时称为“饴”。公元九世纪或十世纪已制成豆浆和豆腐。此阶段中国人民的贡献：6当前第6页\共有89页\编于星期四\19点2.动态生物化学(dynamicbiochemistry)阶段（1903～1950）又称为生理化学（physiologicalchemistry）。主要研究生物体内组成物质的化学变化。分离制备结晶酶；阐明细胞氧化和呼吸链及维生素和激素化学性质与生理作用；建立了有关发酵和三羧酸循环、脂酸的β－氧化作用以及肝中尿素合成的完整生化途径等。7当前第7页\共有89页\编于星期四\19点此阶段中国人民的贡献：我国生物化学家建立了血滤液制备与血糖测定的生化方法；提出了蛋白质变性学说；首先使用定量分析技术研究抗原抗体反应的机理。8当前第8页\共有89页\编于星期四\19点3.功能或分子生物化学（functional

ormolecularbiochemistry）阶段

（1950年至今）

从分子水平探索蛋白质、酶和核酸等生物大分子结构与功能的相关和它们的相互作用，包括蛋白质和核酸的提纯及其化学组成、氨基酸或核苷酸的一级结构序列以及空间构型、构象的确定；建立DNA双螺旋模型；人工合成肽激素、tRNA和核酶；建立分子克隆技术和遗传工程技术等。9当前第9页\共有89页\编于星期四\19点此阶段中国人民的贡献：我国生化工作者于1965年首先成功合成了有生物活性的牛胰岛素；1972年借助X-射线衍射技术研究了猪胰岛素分子的晶体结构；1981年首次合成具生物活性的酵母丙氨酸tRNA；九十年代，成功制备重组Ⅷ因子和促红细胞生成素(EPO)；参与完成人类基因组计划。10当前第10页\共有89页\编于星期四\19点四.生化研究的基本思路

和技术路线：经典的生物化学研究包括三个主要步骤：分离细胞器和生物分子。判断生物分子的结构。分析生物分子的功能和代谢（合成与分解）及其相互作用。11当前第11页\共有89页\编于星期四\19点1.细胞器和生物分子的分离：细胞器是一种独立亚细胞单位。一般采用匀浆及离心等进行亚细胞分离。分离后还必须采用测量“标志”酶及特殊化学成分或电子显微镜观察的方法来评估各亚细胞组分。12当前第12页\共有89页\编于星期四\19点要了解生物分子的结构，首先必须得到纯化的生物分子。用于分离和纯化生物分子的方法很多，例如盐析法、层析法、凝胶过滤、电泳、超速离心等。要得到均一性的生物分子往往需要综合性采用多种方法。13当前第13页\共有89页\编于星期四\19点亚细胞器/单位标志物主要功能细胞核线粒体核糖体内质网溶酶体胞膜高尔基复合体过氧化物酶体细胞骨架细胞质DNA谷氨酸脱氢酶高丰度的RNA葡萄糖-6-磷酸酶酸性磷酸酶Na+-K+-ATP酶,5′-核苷酸酶半乳糖基转移酶过氧化氢酶,尿酸氧化酶没有特征性酶乳酸脱氢酶组成染色体，携带遗传信息。以自身为模板指导合成RNA（转录）。三羧酸循环，氧化磷酸化。蛋白质合成位点（以mRNA为模板翻译成蛋白质）。合成多种脂类，氧化外源性生物分子（细胞色素P450）。含有众多水解酶（酶促降解反应）。转运物质进出细胞，细胞粘附和联系。细胞内的蛋白质分类，糖基化作用，硫化反应。降解部分脂肪酸和氨基酸，产生和分解过氧化氢。微丝、微管、中间纤丝。糖酵解酶类，脂肪酸合成酶。细胞器的标志性成分和主要功能

14当前第14页\共有89页\编于星期四\19点2.生物分子的结构确定：质谱和核磁共振。某些已知特性的酶。X-射线衍射和晶体学方法。15当前第15页\共有89页\编于星期四\19点3.生物分子的功能和代谢分析：1）生物分子的功能分析

人类和动物的研究最初是从动物整体水平开始的，例如对呼吸和消化的研究。将许多整体动物水平的复杂现象转移到体外研究则简单得多。16当前第16页\共有89页\编于星期四\19点策略方法动物整体水平研究去除一个器官(例如切除肝脏)。改变能量来源(例如禁食)。给予药物(例如苯巴比妥)。给予有毒药物(例如四氯化碳)。利用有特定疾病的动物(例如糖尿病)。离体器官灌注肝脏、心脏、肾脏灌注。灌注可以维持离体器官的功能达数小时，可以不受其它器官和神经系统的影响而独立研究某个器官。组织切片细胞研究组织匀浆如肝脏切片。器官切片不受该器官其它部分的影响,但由于缺氧，在几小时内切片组织的状态会变差。如血细胞,因为血细胞相对容易纯化。细胞可在体外较长时间培养。可以加入或去除某些特殊成分而研究它们的作用。通过离心分离亚细胞器。分离细胞器分离亚细胞组分抽提、离心制备，细胞器结构和功能研究。超离心制备，细胞器功能研究。代谢物和酶的分离及特征确定化学组成、组织表达谱、酶学特性及化学反应途径分析。酶或蛋白质的基因克隆生物信息学分析蛋白质功能分析基因克隆及其编码的酶或蛋白质的氨基酸序列分析，基因定位及表达调控分析。序列比较、空间结构及功能域预测。基因敲除或转基因动物，核酸-蛋白质及蛋白质-蛋白质相互作用分析。不同层次研究生物分子功能的方法

17当前第17页\共有89页\编于星期四\19点2）生物分子的代谢分析：生化代谢途径是指一系列由酶催化的生物化学反应，这些反应包括由一个或多个简单的分子合成复杂的复合物以及一个复合物降解为其终产物的过程。

18当前第18页\共有89页\编于星期四\19点某些氨基酸、糖和脂肪酸可以与一个合适的稳定同位素结合，然后注入动物体内或用于体外实验来观测它们的代谢过程。这些研究证实代谢是一个很活跃的过程，细胞内大部分复合物都在不停地合成和降解。19当前第19页\共有89页\编于星期四\19点五.分析生化反应的总体策略：整体动物水平观察和推论某种生化反应或代谢途径的存在→将它定位于一个或多个器官→定位于一个或多个细胞器或亚细胞组分→纯化该反应的底物、产物、酶和辅因子及其它成分

→

确定该反应的体外控制机制→分析该反应的体内调控机制→体内外重建该反应

。20当前第20页\共有89页\编于星期四\19点六.生化研究技术的进步：

生命科学研究的主要目的在于获得最新的基础信息，例如纯化和鉴定新发现的酶及其功能，生物化学与分子生物学新技术、新方法不断涌现，为生命科学研究工作者提供了有用的工具。21当前第21页\共有89页\编于星期四\19点1.细胞器及生物分子的分离与纯化：研究细胞器及生物分子的结构与功能及其代谢和作用机制，必须从组织或细胞中分离出这些生物分子或亚细胞复合物。22当前第22页\共有89页\编于星期四\19点基本技术：匀浆离心层析电泳23当前第23页\共有89页\编于星期四\19点1）匀浆:

破坏细胞或组织的固有结构，使细胞破裂而释放胞内容物。方法:化学(酶消化)、物理(超声)或机械(碾磨)。要求:保持生物分子或亚细胞结构的完整性。措施:合适pH值、合适离子强度、缓冲液、低温(0℃～4℃)、短时间、蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂。24当前第24页\共有89页\编于星期四\19点

使样品绕离心机转轴的中心旋转而获得一个远大于地球重力的沉降应用力，样品介质中不同大小、形状和密度的颗粒将以不同的速度沉降。影响因素:离心力(转速及颗粒与中心轴的距离)，颗粒的大小、形状、密度，介质的粘度。

2）离心：25当前第25页\共有89页\编于星期四\19点低速离心:≤6000r/min、室温，RCF(相对离心力)≤6000g。高速离心:6000～25000r/min、低温，RCF=6000～60000g。超速离心:>25000r/min、低温+真空，RCF=60000～600000g。差速离心:连续用几种递增的离心速率离心。密度梯度离心:样品中不同组份在离心力场的作用下停留于相应密度的支持物层面。类型:26当前第26页\共有89页\编于星期四\19点

根据样品中各组分物理生化特性、分子大小形状、所带电荷、挥发性、溶解性及吸附性或亲和性等的不同而将它们分离。

类型:吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤、疏水相互作用层析、亲和层析、共价层析和金属螯合层析。

3）层析（色谱分析）：27当前第27页\共有89页\编于星期四\19点常用层析法:

薄层层析和纸层析；柱层析；高效液相层析；气相色谱。28当前第28页\共有89页\编于星期四\19点①薄层层析和纸层析:

将样品点在薄层或纸(支持基质又称层析床或固定相)的一端，展层剂(流动相)沿着薄层或纸向上展开并带动样品中的物质迁移。相对迁移率:Rf=组分移动距离/溶剂移动距离；Rx=待测物移动距离/标准物移动距离。

29当前第29页\共有89页\编于星期四\19点②柱层析:

将样品从装有固定相的柱顶部加入，然后在重力或蠕动泵的作用下使流动相过柱并带动样品中的不同组分进入固定相，样品中各组分在固定相中会形成不连续带型，继而用流动相洗脱，分别收集各时间段流出的洗脱液进行定量或定性分析。30当前第30页\共有89页\编于星期四\19点31当前第31页\共有89页\编于星期四\19点4）电泳：

根据带电荷的物质在电场中移动的原理而分离、分析复杂混合物及纯化、鉴定离体生物分子。影响因素:分子所带的净电荷量、分子的形状与大小及电场强度。32当前第32页\共有89页\编于星期四\19点电泳支持物:惰性支持物(如醋酸纤维素):仅提供物理支持，分离效果取决于电荷密度。多孔支持物(如Agarose、PAG):同时利用了分子筛效应，分离效果取决于电荷密度和分子大小及形状。33当前第33页\共有89页\编于星期四\19点电泳缓冲系统:连续缓冲系统:样品、凝胶和缓冲液含有相同的缓冲离子，具有相同的pH值。非连续缓冲系统:凝胶及缓冲液中的缓冲离子和pH值均不同。34当前第34页\共有89页\编于星期四\19点常用电泳技术:基本电泳等电聚焦毛细管电泳双向电泳35当前第35页\共有89页\编于星期四\19点①基本电泳:纸电泳、醋纤膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。36当前第36页\共有89页\编于星期四\19点37当前第37页\共有89页\编于星期四\19点②等电聚焦:在pH梯度下进行。pH梯度由结构类似的小分子量两性电解质形成，等电点(pI)在pH3～10之间。当存在外加电场时，每一种两性电解质向其pI值处移动而形成稳定的pH梯度。电泳过程中每一种带电分子都朝自己的pI位置移动而被分离。38当前第38页\共有89页\编于星期四\19点③毛细管电泳:毛细管电泳的特点在于分辨力高和应用范围广，可以分析极少量的样品(5nl～10nl)。较常应用的有毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦。39当前第39页\共有89页\编于星期四\19点④双向电泳双向电泳是一种分辨力极高的电泳技术，目前广泛用于基因表达谱及蛋白质组学分析，可一次性分离1000多种蛋白质。第一向:根据蛋白质所带的电荷而进行等电聚焦。第二向:利用样品分子的相对分子质量不同，在另一方向上进行SDS。40当前第40页\共有89页\编于星期四\19点41当前第41页\共有89页\编于星期四\19点2Dgelinproteomics42当前第42页\共有89页\编于星期四\19点点匹配结果:

实验组和对照组蛋白点匹配图43当前第43页\共有89页\编于星期四\19点2.生物分子的分离与纯化：1）蛋白质纯化；2）DNA提取；3）RNA提取；4）糖类提取；5）脂类提取。44当前第44页\共有89页\编于星期四\19点1）蛋白质纯化:目的:确定蛋白质的结构、功能及结构与功能的关系；研究酶的动力学及其调节；药用成份的分离与鉴定。方法:匀浆、离心、电泳、过滤、层析、抽提、透析等。要求:合适的缓冲体系、低温、蛋白酶抑制剂。浓度和质量检测:分光光度法、PAGE。45当前第45页\共有89页\编于星期四\19点2）DNA提取:原则:保持核酸一级结构的完整性。去除杂质，保证核酸足够纯。步骤：①破膜释放出目的核酸。②分离通过酶、有机溶剂、调节pH值、离心等手段得到粗制品。③纯化进一步去除杂质。浓度和质量检测:分光光度法、Agarose凝胶电泳。46当前第46页\共有89页\编于星期四\19点基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱M:λDNA/HindIII分子量标准，泳道1～4分别代表4个不同样品的基因组DNA47当前第47页\共有89页\编于星期四\19点3）RNA提取:哺乳动物细胞总RNA主要由rRNA(80%-85%)、tRNA和核内小分子RNA(10%-15%)、mRNA(1%-5%)组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。注意事项:使用RNA酶抑制剂；防止污染。48当前第48页\共有89页\编于星期四\19点总RNA和mRNA的琼脂糖凝胶（1％）电泳图谱49当前第49页\共有89页\编于星期四\19点七.生物分子的结构与功能分析：1.蛋白质结构分析2.酶活力检测3.蛋白质组学分析4.DNA序列分析5.聚合酶链反应（PCR）6.分子杂交7.基因克隆8.基因组文库构建9.cDNA文库构建10.文库筛选11.报告基因检测12.基因芯片13.基因敲除14.RNAi15.转基因动物50当前第50页\共有89页\编于星期四\19点分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成测定多肽链的氨基末端与羧基末端的氨基酸残基把肽链水解成片段，分别进行分析测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。1.蛋白质结构分析:51当前第51页\共有89页\编于星期四\19点通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列分离编码蛋白质的基因测定DNA序列排列出mRNA序列52当前第52页\共有89页\编于星期四\19点2.酶活力检测:酶是一类加快特定生化反应速度的球蛋白。在底物浓度、pH值及温度等适宜的条件下，每种酶控制着一些结构相似的底物生成产物。酶活性单位(SI单位)：在最适条件下，一秒内将1mol底物全部转化为产物所需的酶量。53当前第53页\共有89页\编于星期四\19点3.蛋白质组学分析:一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称为蛋白质组(proteome)。蛋白质是基因功能的实施者，对蛋白质结构、定位和蛋白质-蛋白质相互作用的研究将为阐明生命现象的本质提供直接的基础。方法:二维电泳、质谱技术、蛋白质芯片等。54当前第54页\共有89页\编于星期四\19点4.DNA序列分析:DNA序列分析(DNAsequencing)即测定DNA链中四种核苷酸(碱基)的排列顺序。测序反应使用特异引物与单链DNA模板结合，由DNA聚合酶催化引物延伸，当遇到双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)时即发生碱基特异性链终止，引物延伸合成的新链DNA即是待测DNA模板的互补链。

55当前第55页\共有89页\编于星期四\19点5.聚合酶链反应（PCR）:Polymerasechainreaction（PCR）技术是利用DNA聚合酶在体外条件下，催化一对引物之间特异DNA片段合成的基因扩增技术。PCR包括三个基本过程：①变性；②退火；③延伸。这三个过程组成一个循环周期,每个周期合成的产物又可作为下一个周期的模板，如此循环往复，目的DNA片段的拷贝数呈指数形式扩增。

56当前第56页\共有89页\编于星期四\19点在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。6.分子杂交(hybridization)57当前第57页\共有89页\编于星期四\19点DNA-DNA杂交双链分子变性复性不同来源的DNA分子58当前第58页\共有89页\编于星期四\19点Southern印迹杂交:利用琼脂糖凝胶电泳将经限制性核酸内切酶消化的DNA片段分离，并使这些DNA片段在凝胶原位经碱变性处理后,从凝胶转移至一固相支持物上，再与标记的核酸探针杂交，经检测确定膜上与探针互补的电泳区带位置。59当前第59页\共有89页\编于星期四\19点Northern印迹杂交:用于检测组织、细胞中某基因的表达状态和表达水平。基本原理和方法与Southern印迹杂交相似:RNA在琼脂糖凝胶中电泳分离后，被转移至尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，然后与标记的DNA或RNA探针杂交。60当前第60页\共有89页\编于星期四\19点Western免疫印迹:基本过程与Southern印迹杂交和Northern印迹杂交十分相似，都是由凝胶电泳、转膜、杂交和信号显示等步骤组成。不同之处是Western免疫印迹检测的是蛋白质，使用的凝胶是SDS－聚丙烯酰胺凝胶,所用的探针是蛋白质抗体。61当前第61页\共有89页\编于星期四\19点7.基因克隆:用酶学方法将不同来源的DNA分子在体外进行剪切和重新连接，组装成一个新的DNA分子。在此基础上，将这个DNA分子导入到一定的宿主细胞，使它能够在宿主细胞中扩增，形成大量的子代分子，此过程即称为基因克隆(genecloning)。62当前第62页\共有89页\编于星期四\19点基因克隆包括四个基本技术环节：①目的基因和载体的获得；②目的基因与载体连接，形成重组分子；③重组DNA分子导入宿主细胞；④含有重组DNA分子的细胞的筛选和扩增。63当前第63页\共有89页\编于星期四\19点8.基因组文库构建:基因组文库(genomicDNAlibrary)是含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群体。提纯染色体DNA，通过机械剪切或酶切使之成为一定大小的片段，并与适当的载体DNA连接和转染宿主菌，得到一组含有不同DNA片段的重组分子。64当前第64页\共有89页\编于星期四\19点9.cDNA文库构建:cDNA是指以mRNA为模板，由逆转录酶催化形成的互补DNA（cDNA），其核苷酸序列完全互补于模板mRNA链；再以cDNA为模板，由DNA聚合酶合成第二链，得到互补双链DNA。65当前第65页\共有89页\编于星期四\19点将双链cDNA产物与载体（质粒或噬菌体）DNA重组，并转化到宿主细菌或包装成噬菌体颗粒，得到重组克隆混合体。每个克隆含单独一种cDNA(mRNA)分子，克隆总和则包含细胞的全部mRNA信息。cDNA文库(cDNAlibrary):66当前第66页\共有89页\编于星期四\19点10.文库筛选:文库筛选方法：核酸分子杂交、免疫学方法等。通过文库筛选，可以获得全长基因、分离出对应稀有mRNA的cDNA片段及鉴定目的重组子等。67当前第67页\共有89页\编于星期四\19点11.报告基因检测:报告基因(reportergene)是指那些表达产物容易被检测的基因。利用基因重组技术，将待检测的DNA片段插入报告基因表达载体中报告基因的上游，然后转染合适的细胞并表达，通过测定报告基因的表达产物，即可推测出该DNA片段在基因表达调控中的作用。68当前第68页\共有89页\编于星期四\19点12.基因芯片:基因芯片(genechip)是九十年代中期发展起来的一项前沿生物技术，它融合了生命科学、化学、微电子技术、计算机科学、统计学和生物信息学等多学科的最新技术。69当前第69页\共有89页\编于星期四\19点DNA芯片（基因芯片）

将大量的已知的DNA片段作为探针，有序地、高密度地排列在玻离、硅等载体上。将待测样品用荧光标记物标记，并与DNA芯片进行分子杂交后进行信号检测。通过对芯片扫描获得荧光标记杂交信号图谱。70当前第70页\共有89页\编于星期四\19点

芯片设计

71当前第71页\共有89页\编于星期四\19点目录72当前第72页\共有89页\编于星期四\19点73当前第73页\共有89页\编于星期四\19点13.基因敲除:基因敲除（geneknockout），类似早期生理学研究的三部曲:切除部分→观察整体→推测功能。geneknockout是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它序列相近基因取代，然后从整体及分子水平观察实验动物，推测相应基因的功能。74当前第74页\共有89页\编于星期四\19点基因敲除的技术路线：（1）构建重组基因载体。

（2）用电穿孔、显微注射等方法将重组DNA转入受体细胞核内。

（3）用选择培养基筛选已击中的细胞。

（4）将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。75当前第75页\共有89页\编于星期四\19点

siRNA(smallinterferingRNAs：

21～23核苷酸长的dsRNA小片段

)

14.RNAinterference双链RNA对基因表达的阻抑作用被称为RNA干预（RNAinterference,RNAi），是发生在转录后水平的基因沉默。

76当前第76页\共有89页\编于星期四\19点安德鲁·法尔(AndrewFire，1959年—)，美国斯坦福医学院病理学和遗传学教授克雷格·梅洛(CraigC.Mello,1960年—)，美国马萨诸塞州大学医学院分子医学教授。77当前第