蛋白质组学期末作业

1、一、常用的样品制备技术：1、高丰度蛋白去除技术（抗体亲和法：通过抗原抗体反应原理，用针对样品中多种高丰度蛋白的单克隆或多克隆抗体来特异性去除样品中的高丰度蛋白；染料亲和法：通过高丰度蛋白与染料环结构之间复杂的静电、疏水及氢键相互作用去除样品中的高丰度蛋白，其特异性相对较低。）2、自由流电泳技术（FFE）（FFE分离原理－IEF（等电聚焦）条件下：根据等电点的不同进行样品分离，主要用于分离蛋白质。ZE（区带电泳）条件下：根据样品表面电荷密度不同进行分离，主要用于分离细胞器。FFE的特点：1、是基于液体的样品分离/制备技术，与所有下游分离技术兼容；2、分离非常快；3、液相分离保证初始样品具有很高的回收率；4、采用连续模式，上样和分离连续同时进行；5、分析对象广泛；6、分离条件温和，适合活性生物材料的分离纯化。二、2－DE技术，即双向电泳，是当前蛋白质组学研究中分辨率最高、信息量最大的分离技术。它的优点有：1.可以将上千种不同的蛋白质分离开来，并得到每种蛋白质的等电点、表观分子量和含量等信息。2.如果双向电泳后续接一系列自动化操控，就能大大增加蛋白质分析与鉴定的能力。3.可检测翻译后和翻译过程的蛋白质修饰。缺点有：1、不能进行可完全的2-DE分析。2、许多较大的疏水蛋白质在IEF分析中的结果不理想。3、对相对分子质量过大（）100000）的蛋白质分离分析能力差4、双向电泳不易实现自动化操作，不能适应大规模蛋白质组分析的需要5、双向电泳首先由的主要染色技术（考马斯亮兰染色、银染色）的检测灵敏度较差，且局限在越100倍的动态范围，而细胞中蛋白质表达的动力学范围为百万倍，而且从胶上切割下的蛋白点消化后所产生的肽的回收率常常低于60%，这更会妨碍MS对低丰度蛋白的鉴定。二亚细胞组份的分离与鉴定。分离：最好的分级分离方法是亚细胞器的分离，然后对各细胞器的蛋白质组进行单独研究。一般从三个方面对亚细胞器的纯度进行评价：1．电子显微镜检测2.标志酶活性测定3.Westernblot质膜的纯度鉴定方法：质膜的纯度鉴定方法11、形态学方法（常规透射电镜、免疫电镜观察其切片，纯细胞膜成空的膜泡或片状结构）2免疫印迹法（常用抗体:抗caveolin、Na+--K+--ATPase、flotillin、5`-nucleotidase等）3、酶活测定法（测AP、ADP、Na+-K+-ATPase、5`-nucleotidase的活性）4、膜组分分析法（分析脂质与蛋白质的比例）由于细胞器在细胞内结构上与许多其他亚细胞组分相关联，和细胞器组成的动态性，所以分离得到的细胞器很难达到100%的纯度。所以，亚细胞组分的纯度问题和亚细胞组分生物学功能的深入挖掘是亚细胞蛋白质组研究所面临的挑战。现在已经有一些研究策略来解决这一难点问题，如Schirmer等提出的差减蛋白质组学方法来解决核膜的内质网污染问题；Andersen等提出的蛋白质校正谱图分析法(proteincorrelationprofiling，PCP)来分析可能定位于中心体的蛋白质；Jiang等运用ICAT技术和生物信息学手段的方法来确证线粒体蛋白质，排除污染蛋白。

三、药物蛋白质组学就是蛋白质组学技术在药物研发中的应用。药物蛋白质组学主要应用于：（1）临床前研究-发现所有可能的药物作用靶点，以及针对这些靶点的全部可能的化合物，以及应用蛋白质组学方法研究药物作用机制和毒理学；（2）临床研究方面-发现药物作用的特异蛋白作为患者选择有效药物的依据和临床诊断的标志物，或以蛋白质谱的差异将患者分类并给予个体化治疗。举例：药物蛋白质组学在药物靶点发现和确认中的应用（1）研究人员通过比较给药前后的蛋白质组，找到了药物阿霉素抗乳腺癌的一个作用靶标Hsp27。（2）疟原虫入侵血红细胞的阻断靶点探测：半胱氨酸蛋白水解酶是疟原虫生存必需的酶，Greenbaum等利用靶向半胱氨酸蛋白水解酶的化学探针I125-DCG-04打靶，然后通过抗DCG-04的生物素纯化，得到了半胱氨酸蛋白水解酶类的亚蛋白质组；通过酶活性分析，最终发现在疟原虫的入侵血红细胞的裂殖期，仅有一个有半胱氨酸蛋白水解酶活性的蛋白质—falcipain1；从数据库筛选到falcipain1的抑制剂YA29-Eps，结果证实YA29-Eps可阻断疟原虫的入侵红细胞。四、免疫共沉淀原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。技术用途：1.鉴定两种目标蛋白质是否在体内结合，以及进行结合位点分析；2.筛选一种特定蛋白质的新的作用搭档。染料亲和法：通过高丰度蛋白与染料环结构之间复杂的静电、疏水及氢键、相互作用去除血浆中的高丰度蛋白。特异性相对较低。）4、多维策略的运用联合使用不同技术平台并加以适当改进是目前最通用的手段：主要包括：去除高丰度蛋白、样本预分离系统、分离系统、质谱鉴定系统九：1、肿瘤标志物研究的策略和方法样本收集；分离和鉴定；表达验证；功能验证经典的2-DE在一定范围内得到应用，能直接比较蛋白质水平的差异。②直接质谱法之色谱-质谱联用：蛋白酶解为多肽，再鉴定和定量这些多肽，即可获得原始蛋白的质和量的信息；包括标记法和非标记法；该操作相对简单；但，由于原始蛋白的一些信息会在酶解时丢失(如蛋白降解)，其结果是不全面的③直接MALDI（基质辅助激光解吸电离）／SELDI（表面增强激光解吸电离）,即不酶解，直接进行质谱分析；更适用于高通量研究，但是后续的蛋白质／多肽鉴定往往成为这类实验的瓶颈④其它方法：包括基于抗体的方法,如自身抗体、抗体芯片等。如：血清蛋白组学分析：即分别用病人和正常人的血清作为一抗，筛选肿瘤组织中的差异蛋白质，即肿瘤抗原。其实质是2DE+免疫印迹技术流程：肿瘤组织或细胞总蛋白—2DE分离—转膜—膜与病人血清及对照血清反应—质谱鉴定差异反应点的蛋白—确定肿瘤抗原病人血清及对照血清：差异的就是前者有针对肿瘤抗原的抗体（1）通过蛋白组学技术已经发现的TM（举例）（2）组学技术可提高诊断的敏感性和特异性（3）肿瘤标志物联合检测的必要性研究步骤和内容LCM获得NPC和NP的间质细胞2D-DIGE质谱分析差异点：20