核酸分子杂交演示文稿

核酸分子杂交演示文稿1当前第1页\共有167页\编于星期五\10点核酸分子杂交当前第2页\共有167页\编于星期五\10点3（一）“戴帽安尾（穿靴）”（核内）——5加帽和多聚腺苷酸化及其调控意义

1.mRNAcaping→5’加上GpppmNP帽子，tailing→加上AA···（50~200bp）尾巴。

意义（1）保护作用—保护mRNA免受核酸酶降解，（2）标识作用—为翻译提供识别位点（CBP）。

2.rRNA不易被降解的机理可能是因为其组成核糖体是在核内组装的。

3.tRNA合成后形成特殊的空间结构（三叶草，倒L），可能抵抗降解，半寿期长。当前第3页\共有167页\编于星期五\10点4当前第4页\共有167页\编于星期五\10点5hnRNA内含子剪接位点的碱基顺序具有最强的保守性

5'GT——AG3'当前第5页\共有167页\编于星期五\10点6（二）mRNA的选择剪接对基因表达的调控作用

1.mRNA的选择剪接有多种方式选择剪接方式要点（1）外显子选择Optionexon或称外显子跳跃（exonskipping）→全部保留或至少删除1个或几个外显子。（2）内含子选择Optionintron→内含子全部删除保留1个（近来也有内含子表达的报道）。（3）互斥外显子Mutuallyexclusiveexon→2个外显互斥→在同1个成熟mRNA只出现1个。（4）内部剪接位点Internalsplicesite→通过剪接供点或受点选择决定选择或剪切。m7Gpppm7GpppintronexonexonAAA···AAA···P259当前第6页\共有167页\编于星期五\10点7当前第7页\共有167页\编于星期五\10点82.可变剪接的调控机制⑴SR蛋白家族的调控剪接体的形成与多种蛋白质和RNA复合体密切相关。在可变剪接上保守的SR磷蛋白家族因子的参与起重要作用。SR蛋白家族以不同的质的组成与量的差异选择特定的mRNA前体剪接位点，不同的SR家族蛋白对适当的mRNA前体可以诱导出不同选择的剪接方式，在选择剪接上起决定作用。当前第8页\共有167页\编于星期五\10点9⑵RNP的调节hnRNP-A1在不同组织中的含量变化很大，不参与组成性剪接。在选择5’和3’剪接点时具有可变剪接活性，成为参与可变剪接的调节因子，在体内与SR蛋白共同调节组织特异性的剪接。U5hnRNP在酵母中参与5’剪接点突变的可变剪接。当前第9页\共有167页\编于星期五\10点10⑶

外显子限定模型真核细胞mRNA前体中内含子远远大于外显子，5’与3’剪接位点可以跨越数万个核苷酸准确地组合在剪接体中。有证据表明，在前速激肽原mRNA前体的可变剪接中，外显子下游的5’剪接位点可影响其上游内含子3’的剪接。当前第10页\共有167页\编于星期五\10点11选择剪接对基因表达的调控作用（实例）（1）Bax基因转录产物的选择剪接

Bax基因编码产物是与细胞凋亡有关的分子，（Bax/Bcl2↑调亡↑）

Bax编码产生的Pr.有几种（α、β、γ等），结构略有差异，差异的产生来自mRNA的选择性剪接。①Baxα→保留全部（6个）外显子→共192个密码子→译出192AA多肽②Baxβ→保留全部外显子和第5个内含子（含终止码）→共218个密码子。③Baxγ→保留1、3、4、5、6外显子，删除第2个外显子→译出151AA多肽。当前第11页\共有167页\编于星期五\10点12（2）选择剪接产生的IκBr①NF-κB是非广泛存在的方式作用因子→可与基因上游启动子元件或增加子内部的κB元件结合而→调节基因表达。②NF-κB与IκBr结合时→以无活性NFκB/IκBr复合体（105KD）→存在于胞浆③IκBr基因表达时→通过选择剪接→删除其mRNA中的178个或67个密码子→阅读框移动→产生2种具有新C端Pr.异构体→即IκBr1和IκBr2→2者缺失了1个蛋白激酶A位→该位点磷酸化调节IκBr活性。④剪接产生IκBr异构体→有可能使NF-κB对胞内作出不同响应，尚在研究中。当前第12页\共有167页\编于星期五\10点13当前第13页\共有167页\编于星期五\10点14（三）RNA编辑RNA编辑（RNAediting）是在RNA分子上出现的一种修饰现象。主要指mRNA在转录后因插入、缺失或核苷酸的替换，改变了DNA模板来源的遗传信息，从而翻译出氨基酸序列不同的多种蛋白质。RNA编辑似乎是中心法则的例外。编辑扩大了遗传信息，也可能是生物适应的一种保护措施。P260当前第14页\共有167页\编于星期五\10点151.核苷酸的替换⑴

Ｃ→U替换最典型的例子是载脂蛋白B的RNA编辑。Ｃ→U替换使Apo-B100CAA编码的谷氨酰胺突变为UAA的终止密码子，产生编码Apo-B48的mRNA。在蛋白质水平上只保留了Apo-B100分子N端脂蛋白装配结构域，缺少了C端低密度脂蛋白受体结合区。当前第15页\共有167页\编于星期五\10点16当前第16页\共有167页\编于星期五\10点17⑵

A→I替换在β珠蛋白、c-Myc、成纤维细胞生长因子基因中都有因A→I替换使互补链的U被RNA酶A水解的现象。当前第17页\共有167页\编于星期五\10点182.可读框的改变可读框的改变主要是核苷酸的插入或缺失。G或C的插入则往往是因为模板上连续几个C（或G）之后，互补链因一种滑动力而被添加到RNA中。当前第18页\共有167页\编于星期五\10点19当前第19页\共有167页\编于星期五\10点20当前第20页\共有167页\编于星期五\10点213.向导RNA向导RNA（gRNA）是一种线粒体内转录的短RNA（约55～70核苷酸），能以正常碱基配对或GU配对的方式，选择其5’末端“锚区”在mRNA上的互补序列，为随后插入或缺失U提供模板。当前第21页\共有167页\编于星期五\10点22当前第22页\共有167页\编于星期五\10点23当前第23页\共有167页\编于星期五\10点24（四）mRNA运输的调控→mRNA运输是受控制的。1.3H-udR显示约20%mRNA→胞浆，核内RNA约在1小时内降解成→小片段2.核孔9nm，但可运输>9nm颗粒（如核糖体15nm，在核内组装→入胞作用）

用20nm金颗粒（goldsphere）包装小RNA（如tRNA或5sRNA）→注射到蛙卵（frogoocyte）→可迅速过核孔到→胞浆。但注射入浆→则不能入核说明mRNA主动运输入胞，但机制不清楚。P261当前第24页\共有167页\编于星期五\10点25翻译起始的调控未受精卵：隐蔽mRNA(maskedmRNA)；受精：招募因子(recruitmentfactor)，激活隐蔽mRNA阻遏蛋白的调控：铁结合调节蛋白(regulatoryiron-bindingprotein)翻译起始因子的调控：eIF-2，血红素对珠蛋白合成的调节5′AUG对翻译的调控作用：减少正常AUG启动翻译的作用，使翻译维持在较低水平mRNA5′端非编码区长度对翻译的影响翻译水平的调控当前第25页\共有167页\编于星期五\10点26翻译水平的调控原核生物mRNA的半衰期很短，在翻译水平上的调控对于基因表达的影响也很小。mRNA的二级结构控制着翻译的起始，核糖体蛋白的自体控制对蛋白质的合成起抑制作用。真核生物mRNA的半衰期比原核生物长的多，因此翻译过程受调控的机会也较多。当前第26页\共有167页\编于星期五\10点27翻译水平的调控是真核生物基因表达多级调控的重要环节之一。真核生物翻译水平调控最普遍的机制是起始因子的磷酸化。蛋白质合成装置各元件装配活力的改变是导致蛋白质翻译速率变化的主要因素。翻译的速度和细胞生长的速度是密切协调的。当前第27页\共有167页\编于星期五\10点28一、翻译因子磷酸化调控蛋白质合成因子的磷酸化状态与其对蛋白质生物合成的激活或抑制作用密切相关。1．eIF-4F通过亚单位的可逆磷酸化对蛋白质生物合成进行调控。eIF-4E(α)和eIF-4G(γ/P220)亚基的磷酸化对蛋白质的生物合成有激活作用。当前第28页\共有167页\编于星期五\10点29当前第29页\共有167页\编于星期五\10点302．其他因子磷酸化对翻译的激活作用eIF-4B在促有丝分裂剂作用下，随eIF-4F和核糖体蛋白S6一起，在细胞内被磷酸化，激活起始因子eIF-4A和eIf-4B的活性。3．eIF-2的磷酸化对翻译的抑制作用eIF-2α亚基的磷酸化会导致eIF-2与eIF-2B紧密结合，直接影响了eIF-2的再利用，引起翻译起始作用受阻，从而抑制蛋白质的生物合成。当前第30页\共有167页\编于星期五\10点31阻遏Pr.的调控作用进入胞浆并非所有的mRNA分子→立即与核糖体结合→翻译成Pr.

一些特定的翻译抑制Pr.→可结合到mRNA5’,抑制翻译。如：铁Pr.（ferritin）mRNA5’端非编码区约30个核甘酸序列称为铁反应元件（iron-responseelement）→可折叠成1个茎环（发夹结构）→可结合1个铁结合调节蛋白（regulatoryiron-bindingpro）。当前第31页\共有167页\编于星期五\10点323′3′（1）有铁→不抑制，快译运输工具。（2）无铁结合可运→铁结合Pr.结合mRNA→抑制翻译。铁结合调节蛋白当前第32页\共有167页\编于星期五\10点33Met40S60SmRNAeIF-2B、eIF-3、eIF-6①elF-3②ATPADP+PielF4E,elF4G,elF4A,elF4B，PAB③MetMet-tRNAiMet—elF-2—GTP真核生物肽链合成起始过程60S40SMetGDP+Pi各种elF释放elF-5④Met80S起始复合物当前第33页\共有167页\编于星期五\10点34当前第34页\共有167页\编于星期五\10点35当前第35页\共有167页\编于星期五\10点36翻译起始因子(eIF2)的调控当前第36页\共有167页\编于星期五\10点37(2)翻译起始因子调节蛋白质合成的速度无活性的elF-2

elF-2有活性的elF-2P

P

PPP当前第37页\共有167页\编于星期五\10点385’-AuG对翻译的调控作用（1）按Pr.生物合成模型，90%真核mRNA符合第1AUG规律→译出正常Pr.（2）5’AUG可以减少正常AUG翻译起始作用→使翻译维持在较低水平。原癌基因中是控制原癌基因表达的重要因素→缺失→导致某些原癌基因翻译激活。5’-AUG(1个或数个)第1-AUG非编码区非正常开放阅读框编码区正常开放阅读框5’3’mRNA当前第38页\共有167页\编于星期五\10点39mRNA稳定性调节3′端非编码区结构影响其稳定性：3′端富含A和U的结构，引起mRNA不稳定蚕蛹羽化成蛾后，需大量蛋白水解酶溶解蚕丝蛋白，mRNA半衰期达100小时，其他仅2.5小时翻译水平的调控当前第39页\共有167页\编于星期五\10点40mRNA降解的机制当前第40页\共有167页\编于星期五\10点41小分子RNA（lin-4）对翻译水平影响Lin-14核Pr.调控生长发育的时间选择Lin-4产生2个小分子RNA：1个长度22个核苷酸，另1个在3’端延长至40个核苷酸Lin-4RNA结合→Lin14mRNA3’UTR中的特异顺序→去掉这种顺序→mRNA就不会被抑制翻译。小分子RNA对翻译水平的影响当前第41页\共有167页\编于星期五\10点42新生肽链的水解：酶解肽链N端的第一个氨基酸：稳定化氨基酸（Met、Ser、Thr、Ala、Val、Cys、Gly、Pro）与去稳定氨基酸肽链中氨基酸的共价修饰：磷酸化、甲基化、酰基化通过信号肽(signalpeptide)分拣、运输、定位翻译后水平的调控当前第42页\共有167页\编于星期五\10点43蛋白质合成后的靶向输送（proteintargeting）

蛋白质合成后的去向留在胞浆进入核、线粒体或其它细胞器分泌至体液，输送至靶器官靶向输送--蛋白质合成后，定向地到达其执行功能的目标地点当前第43页\共有167页\编于星期五\10点44分泌性蛋白质(secretoryproteins)穿过合成所在的细胞到其它组织细胞去的蛋白质信号肽(signalpeptide)N-端的一段疏水氨基酸

10～40个氨基酸把合成的蛋白质移向胞膜并与胞膜结合，然后把合成的蛋白质送出胞外N-N端碱性疏水核心区

加工区-C

碱性氨基酸

极性和小侧链氨基酸分泌蛋白当前第44页\共有167页\编于星期五\10点45分泌性蛋白质转运的机制SRP:signalrecognitionparticles当前第45页\共有167页\编于星期五\10点46信号肽识别颗粒信号肽(signalpeptide)当前第46页\共有167页\编于星期五\10点47外膜转运体内膜转运体线粒体蛋白的靶向输送当前第47页\共有167页\编于星期五\10点48细胞核蛋白的靶向输送当前第48页\共有167页\编于星期五\10点49分子生物学

MolecularBiology核酸的分子杂交NucleicAcidHybridizationDepartmentofbiochemistryandmolecularbiology当前第49页\共有167页\编于星期五\10点50

碱基核苷核苷酸RNA

腺嘌呤（A）腺苷腺苷酸(AMP)

鸟嘌呤（G）鸟苷鸟苷酸(GMP)

胞嘧啶（C）胞苷胞苷酸(CMP)

尿嘧啶（U）尿苷尿苷酸(UMP)DNA

腺嘌呤（A）脱氧腺苷脱氧腺苷酸(dAMP)

鸟嘌呤（G）脱氧鸟苷脱氧鸟苷酸(dGMP)

胞嘧啶（C）脱氧胞苷脱氧胞苷酸(dCMP)

胸腺嘧啶（T）脱氧胸苷脱氧胸苷酸(dTMP)DNA和RNA的碱基﹑核苷和相应的核苷酸当前第50页\共有167页\编于星期五\10点51核苷酸之间连接当前第51页\共有167页\编于星期五\10点52

DNA双螺旋结构当前第52页\共有167页\编于星期五\10点53BasepairingoccursinduplexDNAandalsoinintra-andinter-molecularinteractionsinsingle-strandedRNA(orDNA).当前第53页\共有167页\编于星期五\10点54ContentofTable一、核酸分子杂交技术的原理二、核酸探针的制备三、核酸探针的标记四、核酸分子杂交技术五、DNA芯片技术当前第54页\共有167页\编于星期五\10点55一、核酸分子杂交技术的原理

有互补特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。如把一段已知基因（DNA或RNA）的核酸序列用合适的标记物（如放射性同位素、生物素等）予以标记，当作探针（probe),

与变性后的单链基因组DNA或RNA等进行杂交。用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术）把标记物检测出来，就可确定靶核苷酸序列的拷贝数及表达丰度等。

当前第55页\共有167页\编于星期五\10点56当前第56页\共有167页\编于星期五\10点57当前第57页\共有167页\编于星期五\10点58DNA变性是指核酸双螺旋碱基对的氢键断裂，双链变成单链，从而使核酸的天然构象和性质发生改变。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性。当前第58页\共有167页\编于星期五\10点59溶液粘度降低。DNA双螺旋是紧密的刚性结构，变性后代之以柔软而松散的无规则单股线性结构，DNA粘度因此而明显下降。溶液旋光性发生改变。变性后整个DNA分子的对称性及分子局部的构性改变，使DNA溶液的旋光性发生变化。增色效应。指变性后DNA溶液的紫外吸收作用增强的效应。在DNA双螺旋结构中碱基藏入内侧，变性时DNA双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。当前第59页\共有167页\编于星期五\10点60复性指变性DNA在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过程称之为"退火"(annealing)。这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成。DNA的复性不仅受温度影响,还受DNA自身特性等其它因素的影响。当前第60页\共有167页\编于星期五\10点61

应用：1）检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系；2）用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。当前第61页\共有167页\编于星期五\10点62影响杂交的因素核酸分子的浓度和长度温度离子强度杂交液中的甲酰胺核酸分子的复杂性非特异性杂交反应当前第62页\共有167页\编于星期五\10点63

1、核酸分子的浓度和长度：浓度越大，复性速度越快分子越大，复性速度越慢单链探针，浓度增加，杂交效率增加双链探针，浓度控制在0.1~0.5μg，浓度过高影响杂交效率当前第63页\共有167页\编于星期五\10点642、温度：（1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低

20~25℃

（2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低Tm值（3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm

值低5℃当前第64页\共有167页\编于星期五\10点653、离子强度：（1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加（2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度

当前第65页\共有167页\编于星期五\10点664、甲酰胺：（1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在35~42℃杂交（2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68℃杂交当前第66页\共有167页\编于星期五\10点675、核酸分子的复杂性：（1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度（2）Cot½与反应体系中核酸复杂性成正比（3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性当前第67页\共有167页\编于星期五\10点686、非特异性杂交反应：（1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附（2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉当前第68页\共有167页\编于星期五\10点69常用于预杂交的封闭物变性的非特异性DNA：常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性，在交杂反应中可大大减少探针的非特异性结合，使背影清晰。高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力。一般常用小牛血清白蛋白。Home当前第69页\共有167页\编于星期五\10点70二、核酸探针的制备探针（Probe):

一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。当前第70页\共有167页\编于星期五\10点71理想的探针1.要加以标记、带有示踪物，便于杂交后检测和鉴定杂交分子。2.应是单链，若为双链用前需要先行变性为单链。3.具有高度特异性，只与靶核酸序列杂交，不与样本中存在的其它核酸杂交。4.探针长度一般是十几个碱基不等，小片段探针较大片段探针杂交速率快。5.作为探针的核苷酸序列要选取基因编码序列，避免用内含子及其它非编码序列。6.标记的探针应具有高灵敏度、稳定，标记方法简便、安全。当前第71页\共有167页\编于星期五\10点72(一）探针的分类据制备方法及核酸性质不同，可分为：

基因组DNA探针（genomicprobe）

cDNA探针（cDNAprobe）

RNA探针（RNAprobe）寡核苷酸探针（oligonucleotideprobe)据探针标记物的类型不同：同位素标记的探针非同位素标记的探针当前第72页\共有167页\编于星期五\10点731、Genomicprobe

从基因组文库中筛选和纯化获得的一个特定基因（或基因片段）的克隆片段。多为某一基因的全部或部分序列（含有内含子序列），或某一非编码序列，或某一外显子序列。当前第73页\共有167页\编于星期五\10点74①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。②DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法，PCR标记法等，能用于同位素和非同位素标记。特点：当前第74页\共有167页\编于星期五\10点75

cDNA（complementaryDNA）是指互补于mRNA的DNA分子。这种DNA探针不含有内含子序列。因此尤其适用于基因表达的检测。2、cDNAprobe当前第75页\共有167页\编于星期五\10点76

采用基因克隆或体外转录的方法获得。有些病毒的基因组是RNA，分离后经适当标记可制成RNA探针。3、RNAprobe当前第76页\共有167页\编于星期五\10点77RNA探针优势杂交的效率高，杂交体较稳定。RNA中不存在高度重复序列，因此非特异性杂交较少。杂交后RNase将未杂交的探针分子消化掉，使本底降低。当前第77页\共有167页\编于星期五\10点78

寡核苷酸探针是采用DNA合成仪人工合成的，与已知基因DNA互补的，长度可从十几到几十个核苷酸的片段。一般长度为20～50个碱基。亦可根据蛋白质氨基酸序列推导出核酸顺序加以人工合成。4、oligonucleotideprobe当前第78页\共有167页\编于星期五\10点79探针的制备方法探针长度一般以50~300bp为宜。制备方法：1）利用DNA重组技术（基因组DNA探针制备）2）PCR扩增（cDNA探针制备）3）化学合成（寡核苷酸探针制备）当前第79页\共有167页\编于星期五\10点80制备基因组文库细胞DNA酶切重组DNA筛选获目的基因转化细菌，培养存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称为基因组DNA文库（genomicDNAlibrary)。制备探针时，增殖细菌，扩增、提取质粒，用限制酶切，回收特定基因片段，经标记则成为基因组DNA探针。当前第80页\共有167页\编于星期五\10点81ConstructionofaHumanGenomicLibrary当前第81页\共有167页\编于星期五\10点82RestrictionEnzyme-ActionofEcoRI

当前第82页\共有167页\编于星期五\10点83DNArecombination当前第83页\共有167页\编于星期五\10点84cDNA探针制备逆转录合成cDNA分离纯化mRNAPCR扩增当前第84页\共有167页\编于星期五\10点85

根据已知的核酸顺序，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段或根据蛋白质氨基酸序列推导出核酸顺序加以人工合成。化学合成（寡核苷酸探针制备）Geneticcode当前第85页\共有167页\编于星期五\10点86合成寡核苷酸探针注意原则：1）长度（18-50bp);2）G:C对含量40%-60%；3）探针内避免互补；4）避免同一碱基连续出现；5）与非靶序列有70%以上同源性或连续8个以上碱基序列相同，最好不用。Home当前第86页\共有167页\编于星期五\10点87三、核酸探针的标记

为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。当前第87页\共有167页\编于星期五\10点88（一）标记物

1、理想标记物应具备的特性：1）标记前后探针的基本结构、化学性质相同;2）特异性强、本底低、重复性好；3）操作简单、节时；4）安全、无环境污染。当前第88页\共有167页\编于星期五\10点89放射性核素非放射性标记主要有：32P、35S、3H、125I、131I等。优点：灵敏度和特异性极高，可检出样品中少于1000个分子的核酸量。缺点：半衰期短，稳定性差，污染环境、检测需时较长。主要有：生物素、地高辛、辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶及FITC等。优点：具有稳定、安全、经济及实验周期短等特点，近年来应用越来越广泛。缺点：灵敏度低于放射性核素标记的探针2、标记的种类当前第89页\共有167页\编于星期五\10点90（二）探针的标记方法放射性同位素标记法缺口平移法(Nicktranslation)随机引物延伸法(Randomprimerlabelling)末端标记法(Endlabelling)非放射性同位素标记法酶促标记法、化学标记法当前第90页\共有167页\编于星期五\10点91缺口平移法的原理

将DNAaseI的水解活性与大肠杆菌DNApolymeraseI的5`→3`聚合酶活性和5`→3`外切酶活性相结合。DNAaseI在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于E.coli的DNApolI的5`→3`外切酶活性，切去带有5`-磷酸的核苷酸；同时利用该酶5`→3`聚合酶活性，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。

这两种活性同时作用，缺口不断向3`方向移动，DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。当前第91页\共有167页\编于星期五\10点92切口移位（平移）法当前第92页\共有167页\编于星期五\10点93当前第93页\共有167页\编于星期五\10点94当前第94页\共有167页\编于星期五\10点95随机引物标记法原理

用一些六核苷酸作为随机引物，将这些引物和探针DNA片段一起热变性，退火后，引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在其3`-OH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新的标记的探针片段。当前第95页\共有167页\编于星期五\10点96当前第96页\共有167页\编于星期五\10点97当前第97页\共有167页\编于星期五\10点98末端标记法原理（1）一种是在5`末端加成标记法：先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA5`-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP转移加到DNA片段5`-OH上。（2）在探针3`-末端用末端转移酶掺入一个单标记的ddUTP。当前第98页\共有167页\编于星期五\10点99末端标记法当前第99页\共有167页\编于星期五\10点100当前第100页\共有167页\编于星期五\10点101非放射性同位素标记法光敏生物素标记核酸

由一个光敏基团、一个连接臂和一个生物素基团组成。光生物素的光敏基团是-N3，它在光作用下可与核酸中的碱基结合。酶促标记法将标记物预先标记在核苷酸分子上，利用酶促聚合反应将其掺入到待标记的探针分子中去，或将核苷酸分子上的标记基团交换到核酸分子上。当前第101页\共有167页\编于星期五\10点102探针的纯化1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是SephadexG-503、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针当前第102页\共有167页\编于星期五\10点103当前第103页\共有167页\编于星期五\10点104核酸分子杂交信号的检测放射性同位素标记探针：

放射自显影。

非放射性同位素标记探针：

偶联反应+显色反应。当前第104页\共有167页\编于星期五\10点105放射自显影

通过X光片检测放射性核素标记物。其基本原理为：同位素在不断衰变过程中释放出β-粒子，粒子撞击X光片感光层，形成潜在影象，经过显影即可见到成像。当前第105页\共有167页\编于星期五\10点1061．偶联反应可以通过抗原-抗体免疫反应系统与显色体系偶联。地高辛系类固醇半抗原化合物，地高辛标记探针杂交信号可通过酶联免疫法与抗地高辛抗体和碱性磷酸酶的复合物结合，再进行酶促显色反应。2．显色反应（1）酶促显色法：最常用的酶是碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶（2）荧光法：荧光素探针主要用于原位杂交，最常用的为FITC。（3）化学发光法：化学发光指在化学反应过程中伴随的发光反应。化学法检测当前第106页\共有167页\编于星期五\10点107当前第107页\共有167页\编于星期五\10点108地高辛标记探针杂交信号检测Home当前第108页\共有167页\编于星期五\10点109四、核酸分子杂交技术

核酸分子杂交

固相杂交液相杂交印迹杂交原位杂交固相杂交：结合于某种固相支持物上的待测样品与溶解于杂交液中的探针进行的杂交。包括膜上印迹杂交、原位杂交。液相杂交：待测样品和探针均溶于液体中进行杂交反应。当前第109页\共有167页\编于星期五\10点110菌落杂交(Colonyinsituhybridization)常用的固相杂交类型Southern印迹杂交(Southernblotting)

原位杂交(insituhybridization)其他类型杂交（Otherhybridization)斑点杂交(Dotblotting)Northern印迹杂交(Northernblotting)当前第110页\共有167页\编于星期五\10点111核酸分子杂交的基本程序当前第111页\共有167页\编于星期五\10点112

此技术由Southern1975年首先设计。被检测对象为DNA。

（一）Southern印迹杂交当前第112页\共有167页\编于星期五\10点113PaperTowelsSouthernBlottingtissueSDS蛋白酶K酚/氯仿无水乙醇离心当前第113页\共有167页\编于星期五\10点114带有DNA片段的凝胶DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳至膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）上转膜杂交、显影凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印迹杂交的技术流程当前第114页\共有167页\编于星期五\10点1151、待测核酸样品的制备

⑴、裂解或破碎细胞⑵、抽取纯化基因组DNA

⑶、限制酶消化DNA为大小不同的

DNA片段当前第115页\共有167页\编于星期五\10点1162、待测DNA样品的电泳分离

⑴、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶分离小片段用高浓度胶

⑵、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子

DNA泳动慢,小分子DNA泳动快，大小相同的分子处于同一条带

⑶、分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交所用分子量标准可用核素标记当前第116页\共有167页\编于星期五\10点1173、凝胶中核酸的变性（碱变化）凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的单链DNA，中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液。4、Southern印迹指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。当前第117页\共有167页\编于星期五\10点118固相支持物的选择（1）理想的固相支持物应具备的特性①具有较强结合核酸分子的能力②不影响与探针的杂交反应③与核酸分子结合稳定牢固④具有良好的机械性能非特异吸附少当前第118页\共有167页\编于星期五\10点119（2）常用的固相支持物

①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本底低。缺点是DNA分子依靠疏水作用而吸附在膜上，结合不牢固

②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高

③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能力较低当前第119页\共有167页\编于星期五\10点120当前第120页\共有167页\编于星期五\10点121当前第121页\共有167页\编于星期五\10点122当前第122页\共有167页\编于星期五\10点123当前第123页\共有167页\编于星期五\10点124Southern印迹的常用方法

利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上。（1）毛细管虹吸印迹法当前第124页\共有167页\编于星期五\10点125白瓷盘玻璃板滤纸凝胶尼龙膜滤纸吸水纸玻璃板重物吸水纸转膜当前第125页\共有167页\编于星期五\10点126当前第126页\共有167页\编于星期五\10点127（2）真空转移法

此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。当前第127页\共有167页\编于星期五\10点128真空转膜槽滤纸尼龙膜凝胶盖子+-真空转膜当前第128页\共有167页\编于星期五\10点129当前第129页\共有167页\编于星期五\10点130（3）电转法利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。当前第130页\共有167页\编于星期五\10点131当前第131页\共有167页\编于星期五\10点132

5、Southern杂交

⑴、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点预杂交液为不含DNA探针的杂交液。

⑵、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA

杂交，双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交。

⑶、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的DNA。当前第132页\共有167页\编于星期五\10点1336、杂交结果检测

1、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针

2、比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针当前第133页\共有167页\编于星期五\10点1347、Southern杂交在医学中的应用

1、酶切图谱分析

2、特定基因定性和定量

3、基因突变分析

4、限制性片段长度多态性的分析当前第134页\共有167页\编于星期五\10点135（二）Northern印迹杂交

1、基本原理和基本过程与Southernblot基本相同

2、检测目的RNA的存在与否及含量

3、探针可用DNA或RNA片段

4、待测样品为总RNA或mRNA

这是经典的RNA分析法，目前主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。当前第135页\共有167页\编于星期五\10点136Northern印迹与Southern印迹的不同点

1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性

2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理，Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理

3、靶核酸为RNA当前第136页\共有167页\编于星期五\10点137

←28S←18S

RNA电泳当前第137页\共有167页\编于星期五\10点138当前第138页\共有167页\编于星期五\10点139β-1，4糖基转移酶在损伤坐骨神经中的表达当前第139页\共有167页\编于星期五\10点140Northern杂交的主要用途

主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。当前第140页\共有167页\编于星期五\10点141（三）Western印迹杂交

检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法。当前第141页\共有167页\编于星期五\10点142主要步骤：蛋白质样品的制备PAGE电泳蛋白质的电转移：PVDF膜靶蛋白的免疫学检测靶蛋白于第一抗体（一抗）反应与标记的第二抗体（酶标二抗）反应显色反应：酶促反应当前第142页\共有167页\编于星期五\10点143当前第143页\共有167页\编于星期五\10点144当前第144页\共有167页\编于星期五\10点145（四）斑点印迹杂交和狭线印迹杂交Dotblottingandslotblotting原理：是将被检标本的RNA或DNA变性后直接点样吸附于硝酸纤维膜上，然后用标记探针与之杂交。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。

优点：用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量分析，方法简便、快速、灵敏、样品用量少。缺点：不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定比例的假阳性。当前第145页\共有167页\编于星期五\10点146当前第146页\共有167页\编于星期五\10点147当前第147页\共有167页\编于星期五\10点148(五）原位杂交insituhybridization

又分为菌落杂交或噬菌斑、以及真核细胞原位杂交。

它是利用标记的已知核酸探针，在组织、细胞及染色体上检测特异的DNA或RNA序列的核酸杂交技术。组织细胞原位杂交是检测细胞内的核酸片段，它保持了细胞的形态结构和组织的立体构型，适合于核酸定位和分布研究。当前第148页\共有167页\编于星期五\10点149核酸原位杂交的基本步骤当前第149页\共有167页\编于星期五\10点150HPVFISH当前第150页\共有167页\编于星期五\10点151菌落原位杂交

菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。当前第151页\共有167页\编于星期五\10点152当前第152页\共有167页\编于星期五\10点153当前第153页\共有167页\编于星期五\10点154液相杂交

指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。RNA酶保护分析法核酸酶S1保护分析法当前第154页\共有167页\编于星期五\10点155（六）RNA酶保护分析法1、RNA酶保护分析法原理

RNaseA和RNaseT1专一水解杂交体系中的单链RNA，不水解探针RNA与待测RNA互补形成的双链RNA，使杂交分子得到保护，称RNA酶保护分析法。当前第155页\共有167页\编于星期五\10点156

待测RNA样品↓←单链RNA探针液相杂交↓