放射性配体与受体结合分析实验(RBA)方法

内容实验定义与原理实验材料与仪器实验方法Scatchard方程与作图（饱和与竞争实验）RBA的安全问题实验举例当前第1页\共有63页\编于星期五\19点实验定义与原理定义放射性配基与受体结合分析简称为受体放射分析（radioassayofreceptors），它是应用放射性核素标记配基与特异受体相结合，研究受体的亲和力和受体的数量，以及研究受体亚型的常用方法。原理放射性标记配基（激动剂或拮抗剂）和组织、细胞，或含有受体的制剂一起温育，使受体和配基充分结合，形成受体-配基复合物，终止反应后，用过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测定滤膜或沉淀物中的放射性，即可计算出和配基结合的受体的量。当前第2页\共有63页\编于星期五\19点RBA的分类RBA用放射性核素来标记配基，与相应的受体进行特异性结合反应，可对受体的性质进行定性和定量的分析。1、定性RBA：是通过反应的量效关系的变化来判断受体的类型，单位点或多位点结合式，及受体与配体结合的特点，反应的可逆性、协作性等。2、定量RBA：是在已知配体与受体反应性质的基础上，通过结合反应，给出一定量的组织或细胞中能与该放射性配体结合的受体数及结合的平衡解离常数或结合位点数（最大结合容量）。

当前第3页\共有63页\编于星期五\19点实验材料与仪器当前第4页\共有63页\编于星期五\19点实验材料动物组织（皮层、海马、纹状体等）仪器（组织匀浆机、旋涡混合器、低温高速离心机、电热恒温水温箱、-80℃冰箱、制冰机、抽虑瓶、液闪仪等）材料（2ml/6ml分离管、10ul/200ul/1ml枪头、微纤维滤纸等）药品（放射性配基、各种非标计化合物等）当前第5页\共有63页\编于星期五\19点实验仪器组织匀浆机IKA，T10BS25漩涡混合器WH-2当前第6页\共有63页\编于星期五\19点低温高速离心机凯达，TGL20M超低温冰箱海尔当前第7页\共有63页\编于星期五\19点数显恒温水浴锅金燕，HH-S26S制冰机GELIN型号IMS-50automaticiceflakes当前第8页\共有63页\编于星期五\19点电热恒温水温箱循环水式多用真空泵液闪测定计数仪HIDEX，425-034型当前第9页\共有63页\编于星期五\19点实验材料2ml离心管6ml一次性软试管当前第10页\共有63页\编于星期五\19点枪头1ml10ul200ul当前第11页\共有63页\编于星期五\19点TrisPPO与POPOP当前第12页\共有63页\编于星期五\19点过滤装置砂芯过滤装置（抽滤瓶）1000mlWhatmanGF/C玻璃微纤维滤纸40mm当前第13页\共有63页\编于星期五\19点放射性化合物放射性配体低温保存当前第14页\共有63页\编于星期五\19点实验方法流程当前第15页\共有63页\编于星期五\19点实验方法流程1、制备受体样品；2、加样、温育进行结合反应；3、终止反应，分离结合物与游离物4、测定结合物的放射性；5、数据处理。当前第16页\共有63页\编于星期五\19点实验具体操作（D1、D2、5-HT）1、配制各种缓冲液及试剂按处方配比配制各种缓冲液贮备液配制各种非标记配体溶液配制各种受试药物溶液注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：分析天平、移液枪、烧杯、量筒、容量瓶、试管、EP管等试剂：无水乙醇、超纯水、Tris、抗血酸、优降宁、HCl、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、DMSO、甲苯、PPO、POPOP、Methysergide、Butaclamol及5HT等当前第17页\共有63页\编于星期五\19点2、制备膜受体大鼠断头取脑分离出目标组织加10倍体积（V/W）冰冷的缓冲液用组织匀浆机匀浆3次，每次数秒钟，制成组织匀浆液组织匀浆液用低温高超离心机离心（12000转/分）3次，每次20分钟弃上清液，沉淀（膜受体）放-80度超低温冰箱保存备用注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：手术器械、组织匀浆机、制冰机、超低温冰箱、低温高超离心机试剂：超纯水当前第18页\共有63页\编于星期五\19点3、加样

取出膜受体，加入一定体积的冰冷的缓冲液，混匀，使成一定浓度的膜受体溶液。取放射性配体母液，用无水乙醇稀释成实验所需浓度

按以下顺序及比例加入各种反应液。（1）总结合管：100ul膜受体+200ul缓冲液+10ul放射性配体（2）非特异管：100ul膜受体+100ul缓冲液+100ul非标记配体+10ul放射性配体（3）受试物管：100ul膜受体+100ul缓冲液+100ul药物溶液+10ul放射性配体注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：移液枪、烧杯、量筒、EP管等试剂：超纯水、无水乙醇、放射性配体母液

当前第19页\共有63页\编于星期五\19点4、受体配体结合反应

以上各管在加完放射性配体后，立即放入37度的水浴锅中，孵育20分钟。20分钟后把各管放入冰中终止反应。注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：恒温水浴锅，制冰机试剂：无当前第20页\共有63页\编于星期五\19点5、分离游离及结合的放射性配体上述各管在反应结束后，分别倒入抽滤装置进行过滤，并用5-10ml冰冷的缓冲液冲洗滤膜2次。滤膜放入85度烘箱中烘干，随后放入测试管中，关加入一定体积的闪烁液，浸泡过夜。注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：抽滤器、烘箱、滤纸、移液枪、液闪杯试剂：甲苯、PPO、POPOP当前第21页\共有63页\编于星期五\19点6、测定结合型放射配体每分钟放射计数采用放射性计数仪，测定各测试管中结合型放射配体每分钟放射计数注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：液闪仪试剂：无当前第22页\共有63页\编于星期五\19点7、数据处理按以下公式计算各化合物对同位素配基结合的抑制率百分率：抑制率(I%)=（总结合管cpm—化合物cpm）/（总结合管cpm—非特异结合管cpm）×100%化合物每次实验做两复管，进行两次单独实验。当前第23页\共有63页\编于星期五\19点8、各种指标IC50：半数抑制浓度KD：平衡解离常数（mol/L），物理意义为受体有一半结合配基时所需要的配基浓度。Bmax：受体最大结合容量（fmol/mg蛋白质）nH：Hill系数当前第24页\共有63页\编于星期五\19点Scatchard方程与作图

（饱和实验）当前第25页\共有63页\编于星期五\19点Scatchard方程与作图简单单位点系统受体和配体结合反应（Clark模型）条件：（1）配基与受体结合反应为可逆双分子反应；（2）所有受体都是等效和独立的，同一受体的不同分子对配基的亲和力都相等，而且不受邻近受体分子结合配基与否的影响；（3）配体本身不代谢，也不与其它位置结合；（4）生物效应的强度与浓度近似于总配基浓度。当前第26页\共有63页\编于星期五\19点饱和曲线固定的受体数量，固定数量的非标和不同浓度体积的放射性配体当前第27页\共有63页\编于星期五\19点饱和曲线(saturationcurve)1）饱和曲线

受体数量一定，当配体（一般是不同浓度体积的放射性配体与固定数量的非标）的浓度从零开始上升时，形成的复合物也逐渐增多。但由于受体数量有限，又是可逆反应，因此[RL]（受体配体复合物）的增加不是直线上升，而是一条上升先快后慢的曲线，最后绝大部分受体与配体结合时，[RL]的增加就非常缓慢，渐趋水平，即受体已经饱和了，此即饱和曲线。#饱和曲线的作用？Scatchard作图，求得KD与Bmax当前第28页\共有63页\编于星期五\19点2）曲线的高度取决于[RT]。在曲线起始段，曲线上升的快慢即曲线的斜率取决于配基与受体的亲和力，所以，KD越小(亲和力越大)，饱和曲线上升越快，KD越大(亲和力越小)，饱和曲线上升越慢。（即：亲和力越大，受体与配件结合速度越快，时间越短）

k1,v1[R]+[L]－－－－[RL]k2,v2KD＝K2/K1=[R][L]/[RL]当前第29页\共有63页\编于星期五\19点

饱和曲线的形状和KD有关（如图1）。图1KD对饱和曲线的影响

当前第30页\共有63页\编于星期五\19点饱和曲线曲线的高度取决于[RT]（如图2）。

图2[RT]对饱和曲线影响当前第31页\共有63页\编于星期五\19点质量作用定律(Massactionlaw)：受体和配基的结合反应服从可逆反应的质量作用定律，可用下式表示:

k1,v1[R]+[L]－－－－[RL]（1）k2,v2

上式中，[R]和[L]为游离受体和游离配基的浓度，[RL]为复合物浓度，v1和v2为结合速率和解离速率，k1和k2为结合速率常数(associationrateconstant)和解离速率常数(dissociationrateconstant)。

数学表达当前第32页\共有63页\编于星期五\19点根据质量作用定律：v1

=k1[R][L]；v2=k2

[RL]当反应达到平衡后，v1=v2,即:k1[R][L]=k2[RL],则平衡解离常数（KD）的数学表达式为：KD＝K2/K1=[R][L]/[RL]（2）

当前第33页\共有63页\编于星期五\19点Scatchard作图

设[LT]为配体的初始浓度，[RT]为受体的初始浓度（即受体总量），则有：[L]=[LT]–[RL][R]=[RT]–[RL]由式（2）整理可得：KD＝[RT-RL][L][RL]

将上式整理可得：

[RL]=[RT]－1_×[RL]（Scatchard方程）[L]KDKD变形：[RL]为受体与配基特异结合的量，换成[B]表示，[L]为自由配基的量，换成[F]表示，[RT]为受体总量，也即受体最大结合量，换成[Bmax]表示，则上式方程变为 B/F=Bmax/KD-B/KD（[RT]为受体总量，等于[R]和[RL]之和，也是最大结合量Bmax）以复合物浓度[RL]为横坐标，以复合物浓度和游离配体的浓度比值[RL]/[L]为纵坐标作图，即为Scatchard作图。当前第34页\共有63页\编于星期五\19点图3简单单位点系统RBA的Scatchard作图简单单位点系统Scatchard作图为一条直线，斜率为-（1/KD），横轴截距为[RT]，纵轴截距为[RT]/KD（见图3）。由此求得KD与Bmax当前第35页\共有63页\编于星期五\19点Hill方程与作图当一个受体分子可以结合一个以上的配基时，配基受体结合反应不是简单的双分子反应，而是

k1,v1[R]+n[L]－－－－n[RL]，根据质量作用定律推导出Hill方程：k2,v2经过变形得其中n为hill系数，以结合分数B/Bmax对游离配基[L]作图，得Hill作图（如右）。（3）当前第36页\共有63页\编于星期五\19点将（3）式两边取对数

当前第37页\共有63页\编于星期五\19点非特异性结合

(non-specificbinding，NSB)

NSB在RBA系统中，放射性配体除与受体特异性结合外，还可与其他成分（如非特异蛋白、反应容器、分离材料等）结合。NSB的特点

亲和力小而结合容量大，不易被饱和，随反应系统内配体浓度增加而线性增大，而且这种结合与生物效应无关（见图4）。当前第38页\共有63页\编于星期五\19点图4饱和曲线实验中TB、SB和NSB的关系在RBA的数据处理时，测得的总结合的放射性(totalbinding，TB)，必须减去NSB，才能得到特异性结合(specificbinding，SB)的数据。当前第39页\共有63页\编于星期五\19点竞争曲线固定的放射性配基浓度，一定量的受体和不同浓度的未标记化合物当前第40页\共有63页\编于星期五\19点数学表达此实验用于测定非标计药物与放射性配基竞争结合同一受体的能力。通常用IC50和Ki来表示。当前第41页\共有63页\编于星期五\19点闪烁液包括溶剂、闪烁剂和添加剂溶剂：溶解闪烁剂和放射性样品，吸收和传递射线能量。闪烁剂：第一闪烁剂（吸收受激溶剂能量，退激发光）、第二闪烁剂（波长转移，匹配光电倍增管光谱；提高淬灭耐受）添加剂：助溶剂、抗淬灭剂当前第42页\共有63页\编于星期五\19点各受体的非标与同位素受体非标放射性配基受体组织5-HT1A5-HT(serotonin)3H-8-OH-DPAT大鼠纹状体/皮层5-HT2AMethysergide3H-Ketanserin大鼠纹状体/皮层D2Butaclamol3H-Spiperone大鼠纹状体α1Prazosin3H-prazosin大鼠皮层α2Rauwolscine3H-Rauwolscine大鼠皮层M阿托品3H-QNB（毕兹）大鼠脑去小脑/回肠β心得舒3H-DHA鸭红细胞/大鼠脑当前第43页\共有63页\编于星期五\19点RBA的安全问题当前第44页\共有63页\编于星期五\19点β射线当前第45页\共有63页\编于星期五\19点放射型物质发出的射线有三种：天然放射现象当前第46页\共有63页\编于星期五\19点三种射线α射线β射线γ射线当前第47页\共有63页\编于星期五\19点α射线根据射线的偏转方向和磁场方向的关系可以确定，偏转较小的一束由带正电荷的粒子组成，我们把它叫做α射线，α射线由带正电的α粒子组成.科学家们研究发现每个α粒子带的正电荷是电子电荷的2倍，α粒子质量大约等于氦原子的质量.进一步研究表明α粒子就是氦原子核.由于α粒子的质量较大，所以α射线的穿透本领最小，我们用一张厚纸就能把它挡住.当前第48页\共有63页\编于星期五\19点β射线与α射线偏转方向相反的那束射线带负电荷，我们把它叫做β射线.研究发现β射线由带负电的粒子（β粒子）组成.进一步研究表明β粒子就是电子.β射线的穿透本领较强，很容易穿透黑纸，还能穿透几厘米厚的铝板.当前第49页\共有63页\编于星期五\19点γ射线中间不发生偏转的那束射线叫做γ射线，研究表明，γ射线的实质是一种波长极短的电磁波，它不带电，是中性的.γ射线的穿透本领极强，一般薄金属板都挡不住它，它能穿透几十厘米厚的水泥墙和几厘米厚的铅板.当前第50页\共有63页\编于星期五\19点β射线在某种核反应中，一个中子变成一个电子和一个质子.这就是原子核内没有电子，又会放出电子，这就是产生β射线的原因.β射线是一种带负电荷的、高速运行、从核素放射性衰变中释放出的粒子。人类受到来源于人造或自然界(氚，C－14等)β射线的照射，β射线比α射线更具有穿透力，但在穿过同样距离，其引起的损伤更小。一些β射线能穿透皮肤，引起放射性伤害。但是它一旦进入体内引起的危害更大。β粒子能被体外衣服消减、阻挡或一张几毫米厚的铝箔完全阻挡。当前第51页\共有63页\编于星期五\19点放射防护措施当前第52页\共有63页\编于星期五\19点外照防护措施时间防护：尽量减少受照射时间。距离防护：距离越远，辐射能量越低。屏蔽防护：α射线注意防止内照射；β射线可用铝、有机玻璃、塑料等原子序数较低的物质；γ射线可用铅、铁、混凝土等高原子序数物质。当前第53页\共有63页\编于星期五\19点内照射防护措施围封隔离防扩散：“三区配置”法，即清洁区、中间区、活性区；通风良好、独立的下水处理系统；遵守SOP。除污保洁防污染个人防护侵入：穿戴适当的个人保护衣具，如工作服、口罩、鞋、帽等。不准在工作场所进食、吸烟。工作结束后进行卫生清洗，并作污染检测。当前第54页\共有63页\编于星期五\19点放射性“三废”处理基本方法：放置衰变、浓缩储存、稀释排放固体：一般用放置法（半衰期短）、焚化法（废气的处理）、埋藏法（不可燃/焚化残渣）液体：一般用放置法（半衰期短）、稀释法（量少浓度低）、浓集法（富集掩埋）气体：大气排放（低浓度/气溶胶）、过滤器或液体吸收（高浓度）当前第55页\共有63页\编于星期五\19点表面放射性污染的处理皮肤：轻度，大量清水和肥皂清洗；严重，10%EDTA或6.5%高锰酸钾浸泡清洗工作场所表面：轻度，大量清水或洗涤剂清洗；严重，挖去再填充或覆盖油漆/塑料板工作服：轻度，肥皂水；严重，0.02mol/L盐酸、1%草酸洗涤或废物处理仪器及设备：玻璃与陶瓷，3%盐酸/10%枸橼酸浸泡1h后冲洗再用洗液浸泡15min后再清洗；金属，用肥皂、枸橼酸钠、EDTA或其它有机溶剂或超声清洗当前第56页\共有63页\编于星期五\19点例子：M胆碱受体配体结合实验当前第57页\共有63页\编于星期五\19点试剂放射配体：[3H]-QNB（比活度：22ci/mmol）非标：阿托品0.32mol/L蔗糖溶液0.05mol/LTrisHCl缓冲液pH7.5。生理盐水甲苯闪烁液

PPO[2,5-Diphenyloxazole【2,5-二甲基恶唑】]2.5g加POPOP[1,4-Bis(5-phenyloxazol-2-yl)benzene【1,4-双（5-苯基恶唑基-2）苯】]0.05g，溶于500ml甲苯中。当前第58页\共有63页\编于星期五\19点受体组织的制备中枢：大鼠断头取脑，去小脑；20倍0.32mol/L蔗糖制成匀浆；离心，上清液Tris缓冲液悬浮；Lowry法测蛋白。外周肠平滑肌：豚鼠取回肠，生理盐水或Tris缓冲液清洗/保存。当前第59页\共有63页\编于星期五\19点受体配体结合一、饱和曲线：每个反应管中加入200ul固定浓度的膜蛋白（0.2mg/ml）和50ul不同浓度的[3H]QNB(0.1、0.25、0.5、1.01、2.15、3.0、4.26、5.48nmol/L),在非特异结合管中另加入终浓度为10-6mol/L的阿托品，补充Tris缓冲液至总体积1ml，其中之一的操作如下当前第60页\共有63页\编于星期五\19点孵育与测量水温37℃孵育30min，5ml冰冷的Tris缓冲液终止反应；抽虑冲洗游离的[3H]QNB。滤片80℃、30m