生物活性测定技术

生物活性测定技术第一页，共五十四页，编辑于2023年，星期日第13章、生物活性测定技术13.1、概述13.2、酶最适反应条件的测定13.3、酶动力学参数的测定13.4、酶促反应的影响因素13.5、实例第二页，共五十四页，编辑于2023年，星期日

在酶的分离纯化、性质研究以及酶制剂的生产和应用时，都要遇到对酶的活性、纯度及含量进行经常的、大量的测定工作，这是必不可少的指标。

要研究某种酶，首先必须建立起该酶活性的测定方法。酶活性是指酶催化一定化学反应的能力，检查酶的含量及存在，通常是用该酶在一定条件下催化某一特定反应的速度，即酶的活性来表示。

13.1、概述第三页，共五十四页，编辑于2023年，星期日一、酶活性单位

酶活性指的是酶制剂催化能力的大小，它既与酶分子的浓度（量）有关，又与酶分子催化能力的大小（质）有关。人们规定一定的催化能力为一个酶活性单位。液体酶制剂的酶浓度用单位体积酶制剂所含的酶活性单位来表示，即u/ml。对于固体状态的酶制剂，其酶含量可用单位质量酶制剂所含的酶活性单位来表示，即u/mg。第四页，共五十四页，编辑于2023年，星期日国际酶活性单位1961年，国际酶学会议为酶活性单位规定了一个统一的标准，即在特定的条件下（一般为酶催化反应的最适条件），1分钟转化1μmol底物，或转化1μN底物有关基团所需的酶量为1个国际单位（IU）。第五页，共五十四页，编辑于2023年，星期日比活性

酶的纯度往往用比活性来表示，比活性是用同一酶制剂的酶活性除以蛋白质的质量，即单位质量蛋白质所具有的酶活性，常用的单位为u/mgprotein。酶制剂的比活性越高说明酶的纯度越高。第六页，共五十四页，编辑于2023年，星期日二、酶活性测定的主要方法

温度、pH、离子强度（I=(1/2)ΣCZ2）等因素对酶活性有很大的影响，测定酶活性时一般采用最适环境条件。若酶催化反应时需要辅助因子，应加入最适量的辅助因子。底物浓度应采用零级反应时的底物浓度，这时反应速度只与酶浓度有关，而与底物浓度无关。随着反应的进行，产物浓度越来越高，而底物浓度越来越低，导致反应速度下降，所以测酶活性时应测反应的初速度，即反应开始后较短一段时间内的反应速度（反应了的底物不超过5%）。

第七页，共五十四页，编辑于2023年，星期日1

分光光度法（spectrophotometry）

硝酸还原酶将NO3－

还原成NO2－，NO2－

与加入的显色剂对－氨基苯磺酸和α－萘胺反应生成玫瑰红色的偶氮化合物，在520nm处比色可测定产物的生成量。一些脱氢酶以NAD+或NADP+为辅酶，NAD+或NADP+在340nm处光吸收很少，而其还原形式NADH和NADPH在340nm处光吸收较大，因此可以测定340nm处的光吸收变化来检测NADH和NADPH的生成或减少，从而得知脱氢酶的活性。第八页，共五十四页，编辑于2023年，星期日乳酸脱氢酶催化的反应乳酸脱氢酶第九页，共五十四页，编辑于2023年，星期日2旋光测定法（polarimetry）

若底物和产物的旋光性不同，可通过测定反应混合物的旋光性（方向和大小）变化来测定酶活性。第十页，共五十四页，编辑于2023年，星期日3荧光法（fluorescence）

氧化态的黄素（flavin）化合物发出强烈的荧光，还原态失去荧光。NAD+

和NADP+无荧光，而NADH和NADPH有460nm蓝色荧光。荧光法灵敏度高。第十一页，共五十四页，编辑于2023年，星期日4同位素测定法（isotopedetermination）

用放射性同位素标记底物，酶反应后分离产物，测产物的放射性强度。此法灵敏度高，但分离产物较麻烦。若底物或产物中有一种是气体或沉淀，就易于分离。第十二页，共五十四页，编辑于2023年，星期日5电化学方法（electrochemistry）

①pH测定：对于某些酶促反应过程中会产生H＋或减少H＋的反应来说，用1/1000pH单位精度的pH计测定反应液的pH变化，或为保持pH不变而加入酸或碱，记录一段时间内加入的酸碱量。②电位测定：在一些酶促氧化还原反应中，底物和产物具有不同的氧化还原电位，可用由一恒定微电流极化的两个铂电极之间的电位差来测定电位变化。③电流测定：以恒定电压的两个铂电极测电流变化。第十三页，共五十四页，编辑于2023年，星期日6化学分析法（chemicalanalysis）

酶促反应一段时间后，取出一部分反应液，用化学方法分析底物或产物的量。如ACC合成酶的产物ACC的测定：加HgCl2终止反应，加NaOCl-NaOH混合液使ACC转化成乙烯，再用气相色谱测乙烯。1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）第十四页，共五十四页，编辑于2023年，星期日13.2、酶最适反应条件的测定

最适反应温度温度稳定性最适反应pHpH稳定性第十五页，共五十四页，编辑于2023年，星期日一、温度对酶促反应的影响温度-酶反应速率曲线与最适温度（optimumtemperature）Fig.Theeffectoftemperatureonenzymeactivity.第十六页，共五十四页，编辑于2023年，星期日二、pH对酶促反应的影响pH-酶反应速率曲线与最适pH（optimumpH）Fig.TheeffectofpHonenzymeactivity.Tab.OptimumpHofsomeenzymes胃蛋白酶过氧化氢酶胰蛋白酶延胡索酸酶核酶精氨酸酶第十七页，共五十四页，编辑于2023年，星期日13.3、酶动力学参数的测定1．米氏方程Km为米氏常数第十八页，共五十四页，编辑于2023年，星期日（一）酶促反应酶促反应式米氏方程：K4第十九页，共五十四页，编辑于2023年，星期日（二）米氏常数Km1．Km的含义:

当Km=[S]时，V=

Vmax/2，Km值等于反应速率达到最大反应速率Vmax一半时的底物浓度。2．Km的意义Km是酶的一个特征性常数反映酶对底物亲和力的大小鉴别酶的种类

判断可逆反应的速率

第二十页，共五十四页，编辑于2023年，星期日（三）Vmax定义：Vmax表示在一定酶量时的最大反应速率，即酶完全被底物所饱和时的反应速率，与酶活性浓度呈正比。应用：计算酶的转换数（TN，催化常数Kcat）单位时间内每个酶分子将底物分子转换成产物的最大值。计算公式为：

(单位是s-1)计算时要保证酶的浓度单位与底物的浓度单位一致第二十一页，共五十四页，编辑于2023年，星期日酶反应速度与[S]的关系1.[S]＜＜

Km时：

υ=Vmax[S]/

Km

一级反应2.若[S]＞＞Km时：

υ=Vmax

零级反应3.若[S]=Km时：

υ=1/2Vmax

第二十二页，共五十四页，编辑于2023年，星期日Km值的求法：

根据米氏方程双倒数作图法(Lineweaver-Burk)-1/Km1/Vmax斜率=Km/VmaxFig.TheLineweaver-Burkdouble-reciprocalplot第二十三页，共五十四页，编辑于2023年，星期日13.4、酶促反应的影响因素激活剂抑制剂第二十四页，共五十四页，编辑于2023年，星期日1.激活剂激活剂（activator）无机离子中等大小的有机分子蛋白质金属离子:无机阴离子:氢离子K+、Na+、Ca2+、Mg2+

、Zn2+

等。Cl-等。某些还原剂：GSH、Cys、Vc金属螯合剂：EDTA提高酶活性。第二十五页，共五十四页，编辑于2023年，星期日2．抑制剂对酶促反应速度的影响

抑制作用

inhibition抑制剂

inhibitor

抑制作用：酶分子中的必需基团的化学性质受到某种化学物质的影响而改变，导致酶活性降低，甚至丧失，但并未引起酶蛋白的变性作用。第二十六页，共五十四页，编辑于2023年，星期日(1)不可逆抑制作用（irreversibleinhibition)抑制剂以共价键和酶分子上必需基团结合（牢固结合），使酶活性降低或丧失，这种抑制剂不能用透析、超滤等物理方法解除抑制作用。不可逆抑制专一性的不可逆抑制

非专一性的不可逆抑制第二十七页，共五十四页，编辑于2023年，星期日(2)可逆抑制(ReversibleInhibition)

通常以非共价键与酶和（或）酶-底物复合物结合，使酶活性降低或消失。采用透析或超滤等物理方法可将抑制剂除去，使酶恢复活性。类型：竞争性抑制（competitiveinhibition）非竞争抑制（noncompetitiveinhibition）反竞争抑制（uncompetitiveinhibition）

第二十八页，共五十四页，编辑于2023年，星期日1)竞争性抑制ki2ki1第二十九页，共五十四页，编辑于2023年，星期日Vmaxv[S]（不变）KmKm(变大)WithcompetitiveinhibitorNoinhibitor•

竞争性抑制曲线第三十页，共五十四页，编辑于2023年，星期日VmaxKmv1=)[I][ki](1++Vmax1[S]11/[S][I]1/v[I][ki]-Km(1+)-1-1/KmNoinhibitorWithcompetitiveinhibitorFig.Lineweaver-Burkplotofcompetitiveinhibitio13.第三十一页，共五十四页，编辑于2023年，星期日2)非竞争性抑制Fig.Noncompetitiveinhibition第三十二页，共五十四页，编辑于2023年，星期日[S]vVmaxVmax（变小）Km(不变)NoinhibitorWithnoncompetitiveinhibitorFig.Noncompetitiveinhibitio13.第三十三页，共五十四页，编辑于2023年，星期日NoinhibitorWithnoncompetitiveinhibitor[I]1/[S]1/v-1/KmVmax1[I][Ki](1+)[S]1VmaxKmv1=)[I][ki](1++Vmax1)[I][ki](1+第三十四页，共五十四页，编辑于2023年，星期日3)反竞争性抑制第三十五页，共五十四页，编辑于2023年，星期日1/v1/[S]-1/Km(1+[I]/ki)[I]正常第三十六页，共五十四页，编辑于2023年，星期日表.三种抑制作用总结类型米氏方程VmaxKm无抑制剂v=Vmax[S]/(Km+[S])VmaxKm竞争性抑制v=Vmax[S]Ki/(KmKi+Km[I]+Ki[S])不变增加非竞争性抑制v=Vmax[S]Ki/(Km+[S])(Ki+[I])减小不变反竞争性抑制v=Vmax[S]Ki/(KmKi+[S]Ki+[S][I])减小减小第三十七页，共五十四页，编辑于2023年，星期日13.5、实例

菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的酶学性质研究最适温度温度稳定性最适pHpH稳定性酶动力学参数测定金属离子对酶活性的影响有机溶剂对酶活性的影响第三十八页，共五十四页，编辑于2023年，星期日酶活测定：取缓冲液2.4mL于试管中，加入0.5mL0.01mol/LPNPP，45℃水浴10min，加入0.1mL酶液，1min后加入1mL1mol/LNaOH终止反应。对照组先加入1mL1mol/LNaOH，再加入0.1mL酶液。最后用分光光度计测定405nm处的吸光度。一个酶活力单位定义：在此反应条件下，每毫升溶液每分钟催化底物水解，产生1μmol产物所需的酶量。第三十九页，共五十四页，编辑于2023年，星期日1、最适反应温度

在pH9.0条件下，分别测定ALP在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃反应体系中的酶活力。以反应温度为横坐标，相对酶活力为纵坐标，绘制酶活变化曲线。第四十页，共五十四页，编辑于2023年，星期日第四十一页，共五十四页，编辑于2023年，星期日2、温度稳定性研究将纯酶液与适量0.05mol/LTris-HCl缓冲液（pH9.0，含0.1mol/LNaCl）混合，分别在25℃、35℃、45℃、55℃放置4h，每小时测定一次酶活力。以静置时间为横坐标，相对酶活力为纵坐标，绘制酶活变化曲线。第四十二页，共五十四页，编辑于2023年，星期日第四十三页，共五十四页，编辑于2023年，星期日3、最适反应pH

在最适反应温度条件下，分别测定ALP在pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5和11.0反应体系中的酶活力。其中，pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的缓冲液为0.05mol/LTris-HCl缓冲液；pH9.5、10.0、10.5的缓冲液为0.05mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液；pH11.0的缓冲液为磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液。以反应pH为横坐标，相对酶活力为纵坐标，绘制酶活变化曲线。第四十四页，共五十四页，编辑于2023年，星期日第四十五页，共五十四页，编辑于2023年，星期日4、pH稳定性研究

将纯酶液与适量pH值分别为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5和11.0的缓冲液混合，4℃冰箱内放置4h后，在最适反应温度和最适反应pH条件下，测定剩余酶活力。其中，pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的缓冲液.05mol/LTris-HCl缓冲液；pH9.5、10.0、10.5的缓冲液为0