微生物工程(发酵)第三章培养基制备与灭菌

思考题：培养基有哪些化学成分组成？这些成分的来源有哪些（尤其是C、N源）？各成分的作用是什么？前体物质、抑制剂、促进剂的概念发酵工业原料的选择原则有哪些发酵培养基设计的基本原则有哪些发酵培养基设计和优化步骤常用的灭菌方法有哪些？发酵工程培养基灭菌的主要灭菌方法及其各自的优缺点；当前第1页\共有55页\编于星期四\17点按纯度合成培养基

:原料其化学成分明确、稳定

适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律

培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业生产

天然培养基:采用天然原料

原料来源丰富(大多为农副产品)、价格低廉、适于工业化生产

原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性

培养基概述当前第2页\共有55页\编于星期四\17点固体培养基

:适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产

半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为0.5%～0.8%,主要用于微生物的鉴定。液体培养基:80%～90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。当前第3页\共有55页\编于星期四\17点根据生产流程和作用来区分斜面培养基或孢子培养基种子培养基发酵培养基当前第4页\共有55页\编于星期四\17点3.1发酵培养基组成及来源五大元素：水、碳源、氮源、无机盐、生长因子当前第5页\共有55页\编于星期四\17点3.1.1五大营养要素及其主要来源3.1.1.1水分：占细胞重量的80-90%；

对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大

水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。当前第6页\共有55页\编于星期四\17点3.1.1.2碳源可以作为微生物细胞和代谢产物中碳素来源的营养物质；当前第7页\共有55页\编于星期四\17点a.纯糖原料葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖等当前第8页\共有55页\编于星期四\17点b.淀粉质原料直链淀粉（聚合度100-6000）支链淀粉（1000-3000000）当前第9页\共有55页\编于星期四\17点薯类原料：红薯、木薯；谷物原料：玉米野生植物原料：橡果、葛根、蕨根辅助原料：麸皮、米糠当前第10页\共有55页\编于星期四\17点②淀粉、糊精使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类缺点：难利用、发酵液比较稠、一般>2.0%时加入一定的α-淀粉酶，成分比较复杂等等。优点：来源广泛、价格底可以解除葡萄糖效应当前第11页\共有55页\编于星期四\17点c.糖蜜原料：制糖工业中的副产物；甘蔗、甜菜当前第12页\共有55页\编于星期四\17点糖蜜使用的注意点：除糖份外，含有较多的杂质，许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。例：谷氨酸发酵有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）生物素（发酵控制）例：柠檬酸发酵有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）当前第13页\共有55页\编于星期四\17点d.纤维质原料：农作物秸秆；纤维素、半纤维素、木质素当前第14页\共有55页\编于星期四\17点3.1.1.3氮源被微生物利用以构成细胞物质或代谢产物中的氮素的营养物质；当前第15页\共有55页\编于星期四\17点a.无机氮源氨水、硝酸盐、铵盐特点：吸收快，速效氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如：

(NH4)2SO4

→2NH3+2H2SO4

NaNO3+4H2

→NH3+2H2O+NaOH满足菌体生长稳定和调节发酵过程中的pH当前第16页\共有55页\编于星期四\17点b.有机氮源玉米浆、豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、鱼粉、酵母浸出液成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。例玉米浆：①可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸②较多的乳酸③硫、磷、微量元素等当前第17页\共有55页\编于星期四\17点

有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响当前第18页\共有55页\编于星期四\17点3.1.1.4无机盐酶活中心的组成部分维持生物大分子和细胞结构的稳定性调节并维持细胞的渗透压平衡控制细胞的氧化还原电位作为某些微生物生长的能源物质当前第19页\共有55页\编于星期四\17点3.1.1.5生长因子凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。有机氮源是生长因子的重要来源；当前第20页\共有55页\编于星期四\17点3.1.1.6前体物质、抑制剂和促进剂

前体物质指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136当前第21页\共有55页\编于星期四\17点前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%

前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化当前第22页\共有55页\编于星期四\17点3、产物促进剂产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂当前第23页\共有55页\编于星期四\17点

促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。当前第24页\共有55页\编于星期四\17点抑制剂：能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白质变性的物质；

可用透析或超滤的方式去除；

在培养基中添加抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另一代谢途径活跃，从而获得人们所需要的某一终产物或使正常代谢的某一代谢中间产物积累起来;

当前第25页\共有55页\编于星期四\17点3.1.2发酵工业原料的选择原则因地制宜，就地取材；营养丰富，浓度恰当；资源丰富，容易收集；易于储藏；理化性质稳定，成分间无反应；不影响通气、搅拌、产物分离，废物处理方便不含毒副作用的物质价格低廉当前第26页\共有55页\编于星期四\17点3.1.4原料的预处理和加工淀粉质原料的预处理和加工预处理：原料除杂、粉碎；加工：液化淀粉→糊精、低聚糖

糖化产生葡萄糖当前第27页\共有55页\编于星期四\17点加工：糊化、液化淀粉→糊精、低聚糖

糖化产生葡萄糖淀粉颗粒受热并吸水膨胀，体积迅速增大，固态结构被破坏，形成粘稠的液体，称为糊化；糊化的淀粉在酶的作用下，分子链被切断，相对分子量变小，粘度迅速降低的过程称为液化；经液化后的料液中加入一定量的糖化酶（葡萄糖淀粉酶），使糊精或低聚糖水解为葡萄糖，称之为糖化。当前第28页\共有55页\编于星期四\17点当前第29页\共有55页\编于星期四\17点糖蜜原料的预处理去除杂质、胶体、灰分（钙质）及产酸细菌；方法：加酸酸化；

加热灭菌；

静止沉淀；

脱钙；当前第30页\共有55页\编于星期四\17点纤维素原料的预处理及加工：预处理：用化学、物理、生物学的方法，去除半纤维素和木质素，破坏纤维素的结构；加工：酸水解酶水解当前第31页\共有55页\编于星期四\17点3.2发酵培养基的设计和优化目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基当前第32页\共有55页\编于星期四\17点发酵培养基设计的基本原则根据生产菌株的营养特征配置培养基；营养成分的配比适当；渗透压适宜pH值适当各成分的加入次序及步骤适当；当前第33页\共有55页\编于星期四\17点3.2.3发酵培养基设计和优化步骤③各成分最适的浓度（正交实验设计）①根据前人的经验和培养基成分初步确定可能的培养基成分；②通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；当前第34页\共有55页\编于星期四\17点类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化郭秒,食品与工业发酵，2004类胡萝卜素的作用：色素、营养保健当前第35页\共有55页\编于星期四\17点原培养基:当前第36页\共有55页\编于星期四\17点

初步确定可能的培养基成分(以碳源为例)当前第37页\共有55页\编于星期四\17点

通过单因子实验确定适宜的培养基成分(以碳源为例)考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源进一步：乙酸钠的浓度2%比较好当前第38页\共有55页\编于星期四\17点结果：碳源：乙酸钠0.2%氮源：氯化铵0.2%

酵母膏0.03%无机盐:复合无机盐0.05%当前第39页\共有55页\编于星期四\17点

正交设计确定优化的配方当前第40页\共有55页\编于星期四\17点当前第41页\共有55页\编于星期四\17点改进后培养基的发酵结果当前第42页\共有55页\编于星期四\17点例：青霉素发酵发酵摇瓶：玉米浆4%，乳糖10%，(NH4)SO40.8%

轻质碳酸钙1%发酵罐:葡萄糖流加控制总量10-15%，玉米浆总量4-8%

补加硫酸、前体等摇瓶发酵培养基和罐的基础培养差别很大当前第43页\共有55页\编于星期四\17点摇瓶优化配方：菌种筛选，反应器研究的基础当前第44页\共有55页\编于星期四\17点3.3培养基及设备的灭菌常见灭菌方法：加热灭菌过滤灭菌辐射灭菌化学灭菌熏蒸灭菌当前第45页\共有55页\编于星期四\17点1）干热灭菌烘箱内热空气灭菌火焰灼烧干热灭菌160℃，2小时1、高温灭菌当前第46页\共有55页\编于星期四\17点2）湿热灭菌1）巴斯德消毒2）煮沸消毒3）丁达尔灭菌4）常规高压灭菌121℃，15分钟；115℃，30分钟；135-150℃，5-15秒，工业上发酵培养基135-150℃，2-6秒，牛奶或其它液态食品当前第47页\共有55页\编于星期四\17点过滤除菌对不耐热液体培养基和空气灭菌进行过滤除菌；硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜（0.220.45μm）核孔滤器（聚碳酸胶片）当前第48页\共有55页\编于星期四\17点

紫外灭菌紫外线：诱导核酸形成胸腺嘧啶二聚体，从而干扰了核酸的复制；X射线和γ射线能使其它物质氧化或产生自由基破坏和改变生物大分子的结构，以抑制或杀死微生物。当前第49页\共有55页\编于星期四\17点化学药品灭菌：杀菌剂、消毒剂、防腐剂；高锰酸钾漂白粉乙醇当前第50页\共有55页\编于星期四\17点