现代组织化学技术

现代组织化学技术第一页，共四十九页，编辑于2023年，星期日现代组织化学技术(ModernHistochemicalTechnology)

第二页，共四十九页，编辑于2023年，星期日现代组织化学的内容

1、经典组织化学

2、免疫组织化学

3、电镜与免疫电镜组织化学

4、原位杂交组织化学第三页，共四十九页，编辑于2023年，星期日组织化学（Histochemistry）第四页，共四十九页，编辑于2023年，星期日

一、组织化学的基本概念 （一）组织化学的定义

应用化学或物理反应原理，通过显示组织或细胞内的化学成分或酶活性而对其进行定性、定位和定量研究

☆尽量保持组织的原有结构和化学组成

☆组织原位

☆借助显微镜

（二）组织化学与组织学、生物化学的区别组织化学：研究组织细胞内的化学组成及其含量、酶的存在及其活性组织学：研究组织细胞的形态结构及其与功能的关系生物化学：通常将组织和细胞破坏，制成匀浆进行化学测定（不考虑定位）第五页，共四十九页，编辑于2023年，星期日（三）组织化学的基本原理化学试剂+拟检物质反应产物沉淀（有色）化学反应（组织切片或细胞涂片、爬片）（拟检物质所在处）第六页，共四十九页，编辑于2023年，星期日

（四）组织化学技术的基本要求保持组织和细胞的良好形态结构，保持组织和细胞生前的化学成分和酶的活性反应产物不被溶解、不易位、不弥散，保证反应产物的精确定位反应产物具有可视性，反应产物的颜色深度与相应物质含量或酶的活性具有一定的量效关系所用组织化学方法必须具备一定的特异性（仅与某种化学成分发生反应）和灵敏性（能够显示微量的物质）方法稳定并能重复设置必要的对照实验第七页，共四十九页，编辑于2023年，星期日1、固定的目的：

1）保持组织细胞原有的形态结构

2）使组织硬化2、固定的优、缺点：优点：使组织细胞的形态结构得到保持缺点：拟检物质反应性减弱，酶的活性易受损取材：位置准确、速度快、减少挤压、大小适中（宁可面积大、不能厚）二、组织化学标本的制备(一)取材与固定第八页，共四十九页，编辑于2023年，星期日

☆

10%中性缓冲福尔马林：甲醛实际浓度为4％

[甲醛原液10ml,0.1mol/L磷酸缓冲液(PB,pH7.4)90ml混匀]

☆4%多聚甲醛[（HCHO)n，n=8~100]：多聚甲醛40g,0.1mol/LPB500ml，两者混合加热至60℃，搅拌并滴加1mol/LNaOH至溶液清澈，补充0.1mol/LPB至总量1000m1

☆PB和PBS是最常用的缓冲液，0.01mol/LPBS主要用于漂洗组织标本、稀释抗体和血清等。0.1mol/LPB常用于配制固定液及蔗糖等。

为减少固定剂与抗原的交联，在使用醛类固定剂时，应缩短固定时间(8～24h)，降低固定温度(4℃)。3、常用固定剂2）戊二醛：C3H10(CHO)2

2〜4%戊二醛溶液：较好的保存细胞的超微结构，但是保存酶活性效果不佳。1）甲醛：HCHO第九页，共四十九页，编辑于2023年，星期日

3）乙醇：CH3CH2OH2x10minutesacetonefixationwithair-dryinginbetween.Thismayimprovethetissuemorphology.培养细胞、细胞涂片、冰冻切片的固定4%PFA

、甲醇、乙醇、丙酮有固定和脱水的双重作用。能较好的保存酶活性和糖原，但会使组织严重收缩和硬化，常与其它固定剂混合使用甲醇：CH3OH既可作固定剂，又可作脱水剂。能使蛋白凝固，但不影响蛋白质的反应功能基团而保存酶的活性。缺点是易使组织细胞收缩，保持细胞结构欠佳。4℃下10分钟。4）丙酮：(CH3)2CO第十页，共四十九页，编辑于2023年，星期日

1、石蜡切片：

组织取材和固定（甲醛）

→脱水（梯度酒精）

→

透明（二甲苯）

→

浸蜡（石蜡）

→

包埋（石蜡）

→

切片（石蜡切片机）

→

粘片（载玻片）

→

烤片（烤箱）

→组织化学染色程序

组织结构保存良好，结构清晰，定位准确，方便标本长期保存。（二）组织切片的制备第十一页，共四十九页，编辑于2023年，星期日石蜡切片：组织取材和固定（甲醛）

→

脱水（梯度酒精）

→透明（二甲苯）

→浸蜡（石蜡）

→包埋（石蜡）

→切片（切片机）

→粘片（载玻片）

→烤片（烤箱）

→组织化学染色程序

第十二页，共四十九页，编辑于2023年，星期日石蜡切片：组织取材和固定（甲醛）→脱水（酒精）→

透明（二甲苯）→浸蜡（石蜡）→包埋（石蜡）→切片（切片机）→粘片（载玻片）→烤片（烤箱）→组织化学染色程序以肉眼可见自然光线基本透过样品为宜松节油代替二甲苯：作用柔和,制片材料不易硬化，避免二甲苯对人体和环境的危害第十三页，共四十九页，编辑于2023年，星期日石蜡切片：组织取材和固定（甲醛）→脱水（酒精）→透明（二甲苯）→浸蜡（石蜡）→包埋（石蜡）→切片（切片机）→粘片（载玻片）→烤片（烤箱）→

组织化学染色程序

脱水、透明要充分，否则不利于浸蜡。但时间过长会造成组织过硬和抗原损失。较软的组织可选择软蜡（熔点42~50℃）较硬的组织可选择硬蜡（熔点50~60℃）石蜡需要熔化过滤除去杂质第十四页，共四十九页，编辑于2023年，星期日石蜡切片：组织取材和固定（甲醛）→脱水（酒精）→透明（二甲苯）→浸蜡（石蜡）→

包埋（石蜡）→切片（切片机）→粘片（载玻片）→烤片（烤箱）→组织化学染色程序包埋盒包埋模具第十五页，共四十九页，编辑于2023年，星期日石蜡切片：组织取材和固定（甲醛）→脱水（酒精）→透明（二甲苯）→浸蜡（石蜡）→包埋（石蜡）→

切片（切片机）→粘片（载玻片）→烤片（烤箱）→组织化学染色程序必要时哈气、或冰冻第十六页，共四十九页，编辑于2023年，星期日石蜡切片：组织取材和固定（甲醛）→脱水（酒精）→透明（二甲苯）→浸蜡（石蜡）→包埋（石蜡）→切片（切片机）→

粘片（载玻片）→烤片（烤箱）→组织化学染色程序

40~45℃粘片剂第十七页，共四十九页，编辑于2023年，星期日石蜡切片：组织取材和固定（甲醛）→脱水（酒精）→

透明（二甲苯）→

浸蜡（石蜡）→

包埋（石蜡）→

切片（切片机）→

粘片（载玻片）→

烤片（烤箱）

→

组织化学染色程序前的处理→组织化学染色如37度过夜

第十八页，共四十九页，编辑于2023年，星期日组织化学染色程序前的处理:

→

脱蜡（二甲苯）

→纯酒精置换二甲苯

→梯度酒精入水

→

组织化学染色程序

→常规脱水、透明、封片

第十九页，共四十九页，编辑于2023年，星期日第二十页，共四十九页，编辑于2023年，星期日

2、

恒冷箱切片组织取材和固定或不固定→骤冻（液氮，–198℃；干冰，–78℃；

冻结金属座，–30℃）

→

切片（恒冷箱）

→

粘片（载玻片）

→晾片

→组织化学染色程序→常规脱水、透明、封片

第二十一页，共四十九页，编辑于2023年，星期日能够完好地保存细胞膜表面和细胞内多种酶的活性，以及抗原的免疫活性（注意抗体的选择），能够很好地保存脂肪、类脂等成分步骤更简单，快速、省时冰冻过程容易使组织中的水分形成冰晶，破坏组织细胞的形态结构，造成抗原的弥散，从而定位不准确组织过大不容易冻结或组织冻结不均，影响切片及染色效果。不容易制作较薄的切片，不容易做连续切片，不容易长期保存冰冻切片的优点和缺点

第二十二页，共四十九页，编辑于2023年，星期日糖类显示法过碘酸是一种强氧化剂，可将糖分子中的乙二醇基氧化成乙二醛基，后者再与Schiff试剂中的亚硫酸品红（无色）反应，形成不溶性紫红色反应产物对照：先用唾液淀粉酶滴于切片上，37℃30~60min，再按实验步骤进行。

最常用于显示细胞、组织内的多糖和蛋白多糖的方法是过碘酸-雪夫反应（periodicacidSchiff，PAS反应)。

第二十三页，共四十九页，编辑于2023年，星期日脂类物质显示法

苏丹黑B

为脂溶性染料，染色后与组织中的脂类物质结合，故组织中含脂类物质处呈黑色。脂类物质包括脂肪与类脂。标本可用甲醛固定、冷冻切片、用油红O、苏丹黑B等脂溶性染料染色；亦可用锇酸固定兼染色，脂类呈黑色。

油红O是很强的脂溶剂和染脂剂，与甘油三酯结合呈小脂滴状，在脂类中的溶解度比在溶剂中大。当组织切片置人染液时，染料则离开染液而溶于组织内的脂质(如脂滴)中，使组织内的脂滴呈橘红色

第二十四页，共四十九页，编辑于2023年，星期日常用核酸组织化学第二十五页，共四十九页，编辑于2023年，星期日Feulgen反应显示DNA用稀盐酸处理切片，使DNA水解，打开脱氧核酸与嘌呤碱基之间的连接键（糖苷键），形成醛基，再与Schiff试剂作用，形成紫红色反应产物。第二十六页，共四十九页，编辑于2023年，星期日吖啶橙染色显示DNA和RNA吖啶橙（acridineorange，AO）是一种常用荧光染料，与细胞内的DNA、RNA都有亲和力，但有一定的特异性，即结合后发不同颜色的荧光，DNA呈亮（黄）绿色，而RNA呈橘红色至火红色。此法简便快捷，既可染活细胞又可染固定的细胞。

第二十七页，共四十九页，编辑于2023年，星期日methylgreen-pyronin为碱性染料，它分别能与细胞内的DNA、RNA结合呈现不同颜色。甲基绿：与染色质中DNA选择性结合显示绿色或蓝色派洛宁：与核仁、细胞质中的RNA选择性结合显示红色甲基绿-派洛宁染色显示DNA和RNA第二十八页，共四十九页，编辑于2023年，星期日Hoechst33258和Hoechst33342显示DNAHoechst33342和33258主要的特点是能够穿透完整的细胞膜，所以可以用来染活细胞，许多种类的干细胞（如HSC、NSC等）由于可以更有效地将进入细胞的Hoechst染料主动转运到细胞外，所以染色会弱一点，但染固定过的细胞则没有区别。

Hoechst33342比33258更容易透过细胞膜，所以常用来进行活细胞的DNA含量分析。染活细胞时，不同种类的细胞摄入Hoechst的效率不同，染色的强度也不一样，在做细胞流式的时候会看到不同的信号峰。

LABELINGLIVECELLS:LabelingDNAwithHoechst33342亮蓝色荧光第二十九页，共四十九页，编辑于2023年，星期日DAPI显示DNADAPI是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，可用于活细胞和固定细胞的染色。

DAPI像Hoechst染料一样，粘附在DNA双螺旋的小沟区，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料。与双链DNA结合后可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光第三十页，共四十九页，编辑于2023年，星期日confocalimagesofnuclearethidiumbromide(EB)staining溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA。溴化乙锭用标准302nm紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号

溴化乙锭(EB)显示DNA

EB不能透过活细胞膜，但能对固定的细胞及膜有破损的细胞的核进行染色。可以用来检测单链或双链核酸（DNA或RNA），但EB对单链核酸的亲和力相对较小，所以其荧光产率也相对较低。第三十一页，共四十九页，编辑于2023年，星期日吖啶橙能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。溴化乙锭仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。

正常细胞：核染色质结构正常，胞膜完整，着绿色；早期凋亡细胞：核染亮绿色呈致密斑块或碎片状；晚期凋亡细胞：核染橘红色呈致密斑块或碎片状;坏死细胞：胞膜破损、核膜完整，染色质染均匀的红色。AO/EB染色第三十二页，共四十九页，编辑于2023年，星期日碘化丙啶（PropidiumIodide，PI）PI检测试剂盒可用于细胞凋亡检测，也可用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色，染色后可用荧光显微镜检测或流式细胞仪检测。PI是一种DNA结合性染料，其激发和发射波长分别为488nm和630nm，产生红色荧光，但无膜通透性，不能透过活细胞膜，只能染死细胞。Thegreenisthemicrotubulenetwork(partofthecellcytoskeleton)stainedwithanantibodytotubulin.Theredisthenucleusstainedwithpropidiumiodide.

正常细胞：不能着色早期凋亡细胞：呈微弱红光晚期凋亡细胞：红光加强坏死细胞：呈强红色荧光第三十三页，共四十九页，编辑于2023年，星期日在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)位于细胞膜内侧，一旦发生细胞凋亡，可以从细胞膜的内侧迅速翻转到细胞膜外侧，使得PS暴露在细胞膜表面。在Ca2+存在时，AnnexinV与PS有很高的亲和力，可与之迅速结合。PS外翻发生在细胞核破裂、DNA片段化以及凋亡相关蛋白出现之前，这使得AnnexinV与PS的结合成为凋亡早期的一种重要检测标志事件。

PI被用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。坏死细胞可以同时与annexinV-FITC和PI结合显色，而PI则被排除在活细胞(FITC阴性)和早期凋亡细胞(FITC阳性)之外。

第三十四页，共四十九页，编辑于2023年，星期日酶组织化学第三十五页，共四十九页，编辑于2023年，星期日酶组织化学基本反应原理

酶特异性底物+相关捕获剂

反应产物沉淀（有色）

反应产物沉淀（无色）+置换剂酶（孵育液内）（组织细胞内）镜下观察有色沉淀酶组织化学是显示酶的活性第三十六页，共四十九页，编辑于2023年，星期日一、金属-金属盐显示法

方法Ⅱ：铅法酶作用于底物时，其分解产物与底物混合液中某种物质结合，沉着在作用部位。然后结合物被金属置换，通过金属显色来证明酶的存在。或者，酶作用于底物后生成的分解产物，与底物孵育液中的金属离子相结合，直接沉着于酶反应部位，使其显色。方法Ⅰ：钙-钴法第三十七页，共四十九页，编辑于2023年，星期日二、偶联偶氮色素法1、同时偶联法：

该法是孵育液中的底物在酶作用下产生分解产物，后者立即与重氮盐结合（偶联偶氮反应），形成不溶性偶氮色素而显色。2、后偶联法：

该法是为了防止重氮盐对酶的抑制作用，而先使酶作用于底物，使其分解产生反应物沉淀，然后将其浸渍于重氮盐溶液中，使其形成偶氮色素而显色。第三十八页，共四十九页，编辑于2023年，星期日OPO2CaOHN≡NClβ-磷酸萘酚α-萘基氯化重氮盐不溶性偶氮色素N=NOH酶作用第三十九页，共四十九页，编辑于2023年，星期日三、色素形成法1、四唑盐法

主要用于显示脱氢酶。底物中含有四唑盐或双四唑盐。在脱氢酶的作用下，底物释出氢原子，并与四唑盐或双四唑盐形成红色或蓝色的甲

（càn）或二甲

色素。C6H5—CN—N—C6H5N＝N—C6H5酶作用+2HC6H5—CN—NH—C6H5N＝N—C6H5+HCl四唑盐(无色)甲

（红色）Formazandyesareartificialchromogenicproductsofthereductionoftetrazoliumsaltsbydehydrogenasesandreductases.Theyhaveavarietyofcolorsfromdarkbluetodeepredtoorange,dependingontheoriginaltetrazoliumsaltusedasthesubstrateforthereaction.第四十页，共四十九页，编辑于2023年，星期日2、靛酚蓝法：H3CCH3NNH3CCH3NNH2OH+酶作用+

2H2O二甲基–对–苯二胺-萘酚靛酚OO2细胞色素氧化酶过氧化物酶第四十一页，共四十九页，编辑于2023年，星期日酶组织化学注意事项1.选择最适温度、pH值及缓冲液2.为保持酶活性，最好使用冰冻切片，固定时间不能过长3.有些物质能提高或抑制酶的活性，故要选择合适的捕捉剂4.进行对照实验：用酶的抑制剂、用去底物的孵育液、用已确定含该酶的组织细胞进行对照

第四十二页，共四十九页，编辑于2023年，星期日几种酶的反应原理

碱性磷酸酶 酸性磷酸酶 三磷酸腺苷酶 乙酰胆碱酯酶 细胞色素氧化酶 一氧化氮合酶第四十三页，共四十九页，编辑于2023年，星期日

碱性磷酸酶（ALP）1、反应原理（钙-钴法）R-O-PO3Na2R-OH+H3PO4

(β-甘油磷酸钠)

Ca3(PO4)

2Co3(PO4)

2CoS

(棕黑色)2、孵育液的成分：

3%β-甘油磷酸钠10ml

2%巴比妥钠10ml2%CaCl220ml5%MgSO41ml

双蒸水

5ml

ALPpH9.4CaCl2Co(NO3)2(NH4)2S第四十四页，共四十九页，编辑于2023年，星期日

酸性磷酸酶(ACP)1、反应原理（铅法）：

R-O-PO3Na2R-OH+H3PO4

(β-甘油磷酸钠)

2、孵育液的成分：

0.05mol/L醋酸盐缓冲液（pH5.0）10ml3%β-甘油磷酸钠1ml

蔗糖

0.8mg

硝酸铅

10mgACPpH5.0Pb3(PO4)2PbS↓(棕黑色)Pb2+(NH4)2S第四十五页，共四十九页，编辑于2023年，星期日三磷酸腺苷酶(ATPase)

1、反应原理（铅法）：

A—P～P～

P

+H2OA—P～P+H3PO4+

能量

(ATP钠盐)H3PO4+Pb2+Pb3(PO4)2Pb3(PO4)2

+

(NH4)2SPbS↓(棕黑色)

2、孵育液的成分：

ATP二钠盐

10mg

0.2mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.2）10ml0.1mol/LMgSO42.5ml2%Pb(NO3)21.5ml

蔗糖0.8mg

双蒸水5mlATPaseMg2+第四十六页，共四十九页，编辑于2023年，星期日乙酰胆碱酯酶(AChE)1、反应原理（亚铁氰化铜法）：

碘化乙酰硫代胆碱+H2O硫代胆碱+

醋酸硫代胆碱+

铁氰化物亚铁氰化物亚铁氰化物+Cu