蛋白纯化与蛋白电泳

蛋白的提取诱导表达取一环表达菌株平板划线37r,16h，挑单菌落液培37r,250rpm过夜，以1%的接种量转接于大瓶LB或2YT培养基中，37r,250rpm培养约3小时使得OD600达到0.4〜0.8左右，加入IPTG（母液1mM/ml）至终浓度0.1〜1mM,30r,250rpm继续培养4~6小时左右。收菌4°C下，9000g,7min（或10000g,6min）收集菌体，用裂解缓冲液（50mMTris-HCl,pH7.8,0.5MNaCl）充分悬菌，离心去上清，即刻裂解或-80C保存。裂解收蛋白用裂解缓冲液充分悬菌后，加入溶菌酶（lysozyme）至终浓度0.25〜1mg/ml，加入酶抑制剂PMSF（母液100mM溶于异丙醇中）至终浓度0.1〜1mM，加入非离子型表面活性剂10%Tritonx-100至终浓度0.5%，以增加破碎效率，提高蛋白可溶性和特异性结合能力，（如对DNA酶污染要求不高的一般还加少量DNase，避免破碎后溶液粘稠堵塞柱子，如不加DNase，采用大量稀释法、多次离心法和抽滤法缓解样品粘稠的情况），立即冰上超声破碎（3s,15s,200W）30min左右，或利用细胞破碎仪4C下破碎菌体（13000bar,3次），使乳白色浑浊菌液呈现暗黄透亮说明裂解较完全。将破碎完的菌液离心（大管初离：13000g,15min以上；小管再离：18000g,25min以上），可溶性蛋白存在于上清中，若包涵体较多，则需将沉淀用尿素等进一步处理。蛋白裂解液上柱纯化前还需用滤膜过滤处理防止杂质堵塞柱子。SDS蛋白电泳配胶与制胶：1.1分离胶的制备按照配方表依次加试剂。（注意更换枪尖，且避免试剂与皮肤直接接触）项目分高胶＜10%）浓缩胶（5%）ddH20(ml)4.12.730%Acrylamide(ml)3.40.67Tris-HClbuffer(ml)2.5(1.5M,pH8.8)0.5(1.0M,PH6.8)10%SDS(ml)0.10.0410%过硫酸铉Cml）0.10.04TEMED(nl)551.04用移液器吹打混匀几次后将凝胶液注入至长、短玻璃板间的缝隙内。（注意速度适当，太快容易将液体洒出，太慢则可能凝胶过快；0.75mm的板加约3.5ml,1mm的板加约4.5ml）加完凝胶液后，用水封胶以压平胶面，用醇类代替效果更佳。（加入时应轻柔，否则极易引起胶面部分浓度不均）。等待适当时间（一般为30min左右，时间不宜过长，否则水分容易由于暴露在干燥的空气中而蒸发使得胶体变形），待分离胶凝固，凝胶过程中不要随便移动制胶板！倒尽水，并用吸水纸吸干。（尽量吸干，否则可能影响分离胶浓度和均匀度；注意小心操作别弄坏分离胶）1.2浓缩胶制备按照配方表（附后）依次加试剂。用移液器吹打混匀几次后将凝胶液注入胶板（待分离胶的上层水封溶液充分吸干后）。将干燥的梳子缓慢插入胶板中（注意不要产生气泡，不要弄混0.75mm和1.0mm的梳子），等待10min以上待胶完全凝固再用来电泳。1.3蛋白样品准备样品稀释至适当浓度，加入5XSDSLoadingbuffer（成分：250mMTris-HCl（pH6.8）、0.5%漠酚蓝（W/V）、50%甘油（V/V）、10%SDS（W/V）、5%巯基乙醇（（W/V）），离心，沸水煮5min，再离心加样。1.4电泳利用5XSDS电泳runningbuffer（成分：0.125MTris、1.25M甘氨酸（Glycine）、0.5%SDS（W/V），加水至1L）蒸馏水稀释至1X作为电泳缓冲液。浓缩胶采用90V电压，待漠酚蓝指示剂进入分离胶后改成120V电压，漠酚蓝指示剂离胶底端0.5cm左右停止电泳。1.5染色与脱色用考马斯亮蓝染色30~60min，脱色液脱色（适时更换）12h以上至背景颜色退去。1.6拍照脱好色的胶利用实验室凝胶成像仪（白光白背景）拍照保存。Note:凝胶速度和均匀度的影响因素过硫酸铵（AP）:过硫酸铵尽量使用前新配，浓度控制好。TEMED加量：太多凝得快温度：冬天温度低时凝得慢，可考虑适量增加AP和TEMED加量（但尽量不要采取这种方案！因为，增加7AP的量会导致凝胶中离子强度增加，产生样品弥散、拖尾、被卡在某处等等现象，如果不得已采用此方案，一定注意要适量；而TEMED加过量，胶凝得太快，容易使胶体浓度不均，影响电泳结果），或将制胶槽放到温箱里（注意水平放置，有的温箱底部不平整，一不留心会使分离胶呈斜坡状），因为聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶过程不同，前者为化学聚合而后者为物理聚合，故前者聚合时需要能量，在40〜50度下凝胶可以加速聚合，加快凝胶过程。夏天温度高凝得快，为了保证胶的均匀，应该尽可能快的混匀、灌胶。湿度：干燥时水分蒸发快，胶易凝缩（有时分离胶凝固后发现界面比加时矮了一截，不仅仅是因为漏胶之故，还因为胶里水分蒸发），尤其浓缩胶梳子边缘易出现气泡。凝胶液中的空气：在加入AP之前最好把混好的凝胶液抽真空，以除去里面的氧，因为液体中大量的氧存在也影响聚合速度及胶的均匀度。各试剂的配制及质量问题。Native蛋白电泳1.胶的制备采用普通的SDS胶的配方，只是不加SDS等变性剂，以10ml（10%）分离胶、4ml（5%）浓缩胶为例，配方如下表：项目分离胶（10%）浓缩胶（5%）ddH2O(ml)4.12.730%Acrylamide(ml)3.40.67Tris-HClbuffer(ml)2.5(1.5M,PH8.8)0.5(1.0M,pH6.8)10%过硫酸铉（ml）0.10.04TEMED(n1)55104蛋白样品制备将蛋白与5XNativeloadingbuffer（成分：250mMTris-HCl（pH6.8）、0.5%漠酚蓝（W/V）、50%甘油（V/V））混合，上样。电泳5Xnative电泳runningbuffer（成分：0.125M