分子生物学第九章遗传重组详解演示文稿

分子生物学第九章遗传重组详解演示文稿当前第1页\共有72页\编于星期五\17点优选分子生物学第九章遗传重组当前第2页\共有72页\编于星期五\17点概述：◘

只要有DNA，就会发生重组减数分裂温和噬菌体转座子转座◘生存→变异→进化◘广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程当前第3页\共有72页\编于星期五\17点◘

重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子）◘狭义遗传重组：涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流◘遗传重组与重组DNA技术类型需同源序列需RecA蛋白需序列特异性酶位点特异性+-+同源++-转座--+异常--?当前第4页\共有72页\编于星期五\17点第一节同源重组当前第5页\共有72页\编于星期五\17点1、

同源重组（homologousrecombination）:发生在同源DNA序列之间一、特征2、

特征：◘涉及同源序列间的联会配对，且交换的片段较大◘涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂和连接的生化过程

◘存在重组热点◘需要重组酶◘单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号当前第6页\共有72页\编于星期五\17点细线期合线期粗线期双线期终变期◘e.g.Euk.减数分裂时的染色单体之间的交换细菌的转化，转导，接合，噬菌体重组当前第7页\共有72页\编于星期五\17点双倍体染色体交换当前第8页\共有72页\编于星期五\17点二、同源重组的机制1、

断裂复合及Holliday中间体的形成◘

Holliday结构同源重组中连接两个DNA双链的交换中间物含有4股DNA链，在连接处为了转换配对所形成交叉链的连接点为…◘Holliday结构形成的分子机制（断裂复合起始机制）有双链侵入模型、单链侵入模型、双链断裂修复模型等多种◘同源重组都涉及到DNA分子内的－－断裂—复合当前第9页\共有72页\编于星期五\17点3‘5‘5‘3‘Meselson-Radding模型单链入侵模型（链转移模型）置换侵入Loop切除同化异构化分支迁移5’切割当前第10页\共有72页\编于星期五\17点5‘5‘（1）（2）其中－－所有模型和假说都包括切断、链置换、连接等过程双链侵入模型

当前第11页\共有72页\编于星期五\17点双链断裂修复模型当前第12页\共有72页\编于星期五\17点2、分枝迁移和Holliday结构的拆分◘分枝迁移（branchmigaration）－－双螺旋形成的交叉连接以拉链式效应扩散当前第13页\共有72页\编于星期五\17点Holliday的异构化产生重组体的拆分Holliday结构一经生成即可不断地处于异构化－－异源双链heteroduplexDNA重组结果取决于拆分时配对链上的切口位置当前第14页\共有72页\编于星期五\17点（1）（2）（1）（2）◘Holliday结构的拆分产生含异源双链的亲本DNA分子产生重组体当前第15页\共有72页\编于星期五\17点“亲本链”“重组体”当前第16页\共有72页\编于星期五\17点三、原核同源重组（E.coli）◘发生在双方DNA的同源区域

部分复制的染色体DNA之间或染色体DNA与外源DNA之间细菌的转化、结合和转导

1、RecBCD（外切核酸酶Ⅴ）和Chi位点◘具有解旋酶（再旋）活性、ATPase活性、核酸外切酶活性、

序列特异性的单链内切酶活性◘单链内切酶活性和解旋酶活性使DNA产生具有游离末端的单链－－－RecA的作用位点◘RecBCD有固定切割位点当前第17页\共有72页\编于星期五\17点3‘◘RecBCD的识别和切割位点a、RecBCD结合在DNA的平头末端（产生机制不清楚）b、外切、解链、移动（ATP）c、兔耳状loop结构产生（再旋酶活性低于解旋酶活性）d、RecBCD在loop单链区的

chi位点3‘方4～6NT处切断单链（单链内切酶）☀

chi位点：GCTGGTGG目前发现的重组热点

E.coli含1000个.当前第18页\共有72页\编于星期五\17点e、RecBCD切割产生3’单链末端当前第19页\共有72页\编于星期五\17点

2、RecA蛋白

（1）

活性a、RecA有单、双链DNA

结合活性b、RecA有NTPase活性（底物差异活性）与单链DNA结合时活性最大---依赖于DNAc、RecA有启动一个分子的单链侵入到另一双螺旋分子的能力，即联会同源DNA

（但其靶DNA必须有缺口－－结合DNA）当前第20页\共有72页\编于星期五\17点当前第21页\共有72页\编于星期五\17点RecA入侵单链被置换连RecA引发链侵入模型当前第22页\共有72页\编于星期五\17点RecApromotestheassimilationofinvadingsinglestrandsintoduplexDNAsolongasoneofthereactingstrandshasafreeend.

RecA启动的单链入侵当前第23页\共有72页\编于星期五\17点RecA引起的链交换和Holliday结构的生成

当前第24页\共有72页\编于星期五\17点

（2）RecA蛋白催化双链和单链DNA的反应阶段a、联会前阶段（缓慢）

RecA与单链结合b、单链与双螺旋的互补链迅速配对，形成双链连接分子Holliday（5‘侵入）c、从双螺旋结构中缓慢置换一条链产生一段长的异源双链DNA反应结束时，RecA结合到双链上◘其中—单链同化有固定的方向入侵单链为5’－3‘双链DNA的互补链是3’－5‘当前第25页\共有72页\编于星期五\17点当前第26页\共有72页\编于星期五\17点◘RecBCD和

RecA的共同作用当前第27页\共有72页\编于星期五\17点

3、原核同源重组的其它蛋白

需要E.coli中三个基因ruvA,ruvB和ruvC的产物a、RuvA识别Holliday结构的连接点b、RuvB为分枝迁移提供动力（ATPase10～20bp/s）c、RuvC核酸内切酶---专一性识别Holliday结构的连接点体外切段连接点以拆分重组体当前第28页\共有72页\编于星期五\17点◘E.coli重组的各阶段（损伤修复）损伤DNA复制产生缺口RecA链交换第二次链交换DNApol通过DNA合成填满缺口RuvA,B分枝迁移RuvC切割Holliday连接点当前第29页\共有72页\编于星期五\17点第二节位点专一性重组当前第30页\共有72页\编于星期五\17点一、位点专一性重组（site-specificrecombination）1、概念：发生在专一序列而顺序极少相同的DNA分子间的重组2、特征：◘在特定的结合序列部位，有专一的酶催化断裂重接----产生精确的DNA重排◘都具有整合作用的两个基本特征a、典型的保守性重组---交换是相互的和保存原先的DNAb、发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列的专一性核苷酸上Euk.中专一性抗体基因的构建当前第31页\共有72页\编于星期五\17点二、λphage的整合与切除1、实现机制：均是通过---细菌DNA和λDNA上特定位点之间的重组2、特定位点-----附着位点（attachmentsiteatt）◘E.coliattB含BOB’三序列23bp◘λphage

attP含POP’三序列240bp◘核心序列“O”完全一致

（同源部分）---位点特异性重组发生的地方◘B,B’,P,P’---臂当前第32页\共有72页\编于星期五\17点3、整合过程◘整合后的附着位点为attL（BOP’）attR（POB’）◘整合位点---attB、attP切除位点---attL、attR◘整合过程需要λ整合酶

（integraseInt）（λ编码）和寄主的整合宿主因子IHF（integrationhostfactor）共同作用当前第33页\共有72页\编于星期五\17点溶源性细菌(lysogen)溶菌周期（lysis）原噬菌体当前第34页\共有72页\编于星期五\17点当前第35页\共有72页\编于星期五\17点4、整合分子机制◘核心序列O全长15bp，富含A-T◘发生在O内的重组交换位点相距7bp◘整合酶的结合位点：attP240bp、attB23bp(两者的作用不同)◘attP位点的负超螺旋为重组所必须---加强了Int和IHF的亲和力-----高剂量的蛋白维持单链重组所必需的结构◘Int结合----核心序列的反向位点（切割位置）----结合在att臂上（臂与核心区靠近）当前第36页\共有72页\编于星期五\17点◘整合体及其作用整合体（intasome）---Int和IHF结合到attP时的复合物◘整合体捕获attB说明-----

a、attB和attP的最初识别靠Int识别两序列的能力b、两序列的同源性在链交换时为重要因素当前第37页\共有72页\编于星期五\17点◘Int蛋白能切断DNA，并使它重新连接，近而使holliday结构拆分◘重组时attP和attB部位交叉断裂，互补单链末端进行交叉杂交当前第38页\共有72页\编于星期五\17点5、整合与切除的控制（1）整合◘CⅡ---促使阻遏蛋白CⅠ的产生---与intgene的PI结合，转录产生Int蛋白---且PI位于xis基因内，CⅡ与PI结合导致xisgene失活（2）切除◘寄主SOS反应时---RecA大量产生，促使阻遏蛋白CⅠ的水解

---把OL和OR从阻遏状态释放出来---从PL转录使int和xis表达当前第39页\共有72页\编于星期五\17点四、依赖于同源重组的位点特异性的序列代换

-----酵母MAT序列的转换1、酵母结合型的转变---DNA序列的代换，而不是互换---依赖于序列的同源性（被代换的序列命运是被降解调---突变试验）当前第40页\共有72页\编于星期五\17点2、同源序列匣子WXYZ1Z2totalHML723704747

239882501MAT723704747

239882501MATa723704642239882369HMRa704642239881585当前第41页\共有72页\编于星期五\17点3、转换过程◘内切酶(HO)识别、切割--Y/Z1交界处---起始MAT序列的转换(双链断裂)［HM匣子受Sir阻遏蛋白的保护］①当前第42页\共有72页\编于星期五\17点◘Y区域被降解，直到Yα和Ya相同的部分或一直到X区域①②当前第43页\共有72页\编于星期五\17点◘四个断头侵入供体匣子的同源部分并与其中互补链配对◘以供体DNA为模板复制Y区域，holliday结构形成③④当前第44页\共有72页\编于星期五\17点◘Holliday结构的拆分，产生新的MAT匣子和这次转换中的供体匣子当前第45页\共有72页\编于星期五\17点4、特征---同源重组和位点特异性重组特征都具有◘需要大范围的同源序列◘需要重组酶系（rad52基因产物、位点特异性的HO内切酶）当前第46页\共有72页\编于星期五\17点第三节细菌中的转座成分当前第47页\共有72页\编于星期五\17点一、转座成分概述1、转座子(元)或转座元件(transposonortransposableelement):基因组上不必借助于同源序列就可以移动的DNA片段，它们可以直接从基因组的一个位点移到另一个位点（供体和受体）转座（transposition）：转座元的转移过程（不十分确切）2、发现和发展◘1914A.Emerson1936Marcus.M.Rhoabes玉米果皮、糊粉层花斑突变玉米籽粒糊粉层色素不稳定遗传机理跳跃基因（jumpinggene）◘1947冷泉港实验室（美）BarbaraMcClintock当前第48页\共有72页\编于星期五\17点◘基因转座现象的再次发现与证实

在一个操纵子中，与操纵基因毗连的结构基因发生终止突变后，它除了影响该基因本身产物的翻译外，还影响其后结构基因多肽的翻译，并且具有极性梯度的特征。

插入型极性突变的发现与机理Operon&PolarityMutation极性突变的基本概念当前第49页\共有72页\编于星期五\17点A酶活性

OgeneZ基因终止突变位

点离O基因的距离

IpoZYA当前第50页\共有72页\编于星期五\17点a)不依赖供体序列与靶位点间序列的同源性b)转座不是简单的转移，涉及转座子的复制Hotspots(热点)Regionalpreference(在3kb区域内的随机插入)d)某些转座因子（Tn3）对同类转座因子的插入具有排他性

（免疫性）e)靶序列在转座因子两侧会形成正向重复f)转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应3、转座重组的特点c)转座插入的靶位点并非完全随机（插入专一型）当前第51页\共有72页\编于星期五\17点二、Prok.转座子种类◘两种类型：简单转座子（simpletransposon）（插入序列insertionsequenceIS）复合转座子（compositetransposon）◘共同特征：a）两端有20～40bp的IRb）具有编码转座酶（transposase）的基因1、插入序列◘最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分◘命名：IS＋编号（鉴定类型）长度700～2000bp当前第52页\共有72页\编于星期五\17点◘特点：a）两端IR为转座酶的识别位点（突变）b）插入靶位点后会出现靶位点的正向重复（3～9bp）当前第53页\共有72页\编于星期五\17点◘IS可以正反方向插入到DNA（宿主、质粒或某些噬菌体），常对插入位点后面的基因表达功能产生极性效应当前第54页\共有72页\编于星期五\17点a)Tn/TnAfamily

l具有IR、转座酶基因、调节基因（解离酶）、抗抗生素基因

l

Tn1(AmpR)Tn2(AmpR)Tn3(AmpR)Tn4(AmpRStrR)Tn5(KanR)Tn6(kanR)Tn7(StrRTmpR)Tn9(CamR)Tn10(TetR)

2.5kb20kb

Tn3IRTnpAResTnpRAmpRIR38bp38bp转座酶

regulatorβ-内酰胺酶

2、复合转座子◘两种类型当前第55页\共有72页\编于星期五\17点b）两端重复序列为IS的复合转座子

e.g.

IS插入到功能基因两端，可能形成复合转座因子ISISISISLISR臂中心区臂transposition当前第56页\共有72页\编于星期五\17点◘当两个IS组件相同时，其中任一个都可行使转座功能◘不同时，主要依靠一个◘两侧的IS既可以是IR，又可以是DR状态（IR多）当前第57页\共有72页\编于星期五\17点3转座噬菌体Muphage

（巨型转座子）

C

repressorforA,BB33kd与转座有关A70kd转座酶U,S毒性蛋白attL,attR与寄主同源，反向重复，转座必需GinG区倒位酶attLCABSUattR150bp1.5kb

G倒位区38kbPgin◘以E.coli为寄主的温和型噬菌体（溶源、裂解）当前第58页\共有72页\编于星期五\17点◘Mu的插入途径a）侵入的Mu在溶源化过程中任意插入寄主DNA（两侧各5bp的靶位点序列重复）b）进入裂解生长后，复制产生后代MuDNA几乎全部插入寄主DNA中，并可继续转座（形成寄主DNA和Mu的共合体），噬菌体成熟时，切段共合体包装当前第59页\共有72页\编于星期五\17点三、转座子的转作机制及模式◘三种类型：复制型、非复制型和保守型1、复制型转座模式◘实质：转座子元件被复制并被移动到受体位点，最终转座过程扩增了转座子的拷贝（供、受点）◘需两种酶：转作酶（作用于原拷贝两末端）解离酶（作用于复制后的拷贝）◘模式：当前第60页\共有72页\编于星期五\17点◘两大步a)共合体形成切口－连接－复制当前第61页\共有72页\编于星期五\17点b)拆分靶位点的DR形成当前第62页\共有72页\编于星期五\17点当前第63页\共有72页\编于星期五\17点2、非复制型转座模式◘供体上最终产生双链断裂◘供体位点如不能被修复则有致