分子生物学基本技术定稿

第一节分子杂交Section1MolecularHybridization当前第1页\共有58页\编于星期五\17点一、核酸分子杂交

1.核酸分子杂交基本原理——核酸变性与复性◆核酸变性(denaturation)：由于外界因素影响，使核酸分子的空间结构改变，并引起核酸理化性质和生物学功能发生改变的现象。其本质是维持核酸空间结构的氢键和/或碱基堆积力受到破坏。◆核酸复性(renaturation)：变性核酸在适当条件下根据碱基配对原则重新恢复空间结构的过程。复性可使核酸的理化性质得到恢复。当前第2页\共有58页\编于星期五\17点变性复性DNA的变性与复性当前第3页\共有58页\编于星期五\17点◆核酸变性因素：加热

pH

有机溶剂(如乙醇、尿素、甲酰胺、丙酰胺等)等◆核酸复性因素：核酸序列复杂程度：越简单复性越快核酸片段的大小：越小复性越快核酸浓度：浓度越高复性越快离子强度：强度越高复性越快当前第4页\共有58页\编于星期五\17点◆增色效应(hyperchromiceffect)：核酸变性时，由于碱基外露使260nm处的紫外吸收值增加，这种现象称为增色效应。反之，称为减色效应(hypochromiceffect)。不同来源DNA热变性时的增色效应7080901001.01.21.4A260nm温度(℃)肺炎球菌(38%G+C)大肠杆菌(52%G+C)粘质沙雷菌(58%G+C)草分枝杆菌(66%G+C)当前第5页\共有58页\编于星期五\17点◆熔解温度(meltingtemperature，Tm)：指50％DNA双链变性时的温度，也称解链温度或变性温度。此时溶液的紫外吸收值达到最大值的一半。DNA的热变性变性比率％()501000758085温度(℃)TmTm当前第6页\共有58页\编于星期五\17点◆影响Tm值的因素：①DNA的均一性均一DNA解链温度范围较不均一DNA窄②DNA中的G+C含量

Tm＝69.3＋0.41·x(G+C)

x(G+C)为(G+C)的摩尔分数③溶剂的性质离子强度低，Tm较低，且溶解温度范围窄当前第7页\共有58页\编于星期五\17点◆核酸分子杂交(hybridization)：两个不同来源、具有互补碱基序列的单链核酸分子形成双链核酸分子的过程。混合后复性核酸杂交杂合双链当前第8页\共有58页\编于星期五\17点◆退火(annealing)：DNA在热变性后，经缓慢冷却，并将温度维持在一定范围(一般比Tm低25~30℃左右)时，单链DNA可重新恢复双链结构。2.核酸分子杂交中的探针(probe)(1)核酸探针的概念◆能与特定的靶分子(DNA或RNA)发生特异性结合的核酸分子。当前第9页\共有58页\编于星期五\17点(2)核酸探针的种类与应用◆据探针的来源和性质：基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针及寡核苷酸探针。◆探针应用原则：探针与被检测的目的核酸之间在核苷酸序列上要具有高度的特异性。①基因组DNA探针◆根据实验目的选择基因组中的一段DNA序列，并将此DNA序列克隆至工程菌经扩增后可获得大量探针。当前第10页\共有58页\编于星期五\17点②cDNA探针◆cDNA(complementaryDNA)：以mRNA为模板，经逆转录产生的能与模板互补的DNA链。◆cDNA探针无内含子，尤适用于基因表达的检测。③RNA探针◆通常利用体外转录体系，以cDNA为模板制备。◆优点是探针为单链，具有很高的杂交效率。◆缺点是RNA易于降解，标记方法复杂。当前第11页\共有58页\编于星期五\17点④寡核苷酸探针◆在体外经人工合成的单链DNA分子，可与靶分子中的一段序列互补。(3)核酸探针的标记①标记物◆同位素标记物：32P、3H、35S、14C、125I、131I。◆非放射性标记物：地高辛、生物素和荧光素。当前第12页\共有58页\编于星期五\17点32P及35S标记的NTP结构图4Li＋dUTP连接臂敏感性酯键地高辛甾醇半抗原Dig-dUTP当前第13页\共有58页\编于星期五\17点Ⅰ.用T4多核苷酸激酶进行末端标记

Ⅱ.切口平移法

Ⅲ.随机引物法

Ⅳ.粘性末端法

Ⅴ.聚合酶链反应(PCR)法②标记方法(4)标记探针的检测①放射自显影技术②免疫法检测当前第14页\共有58页\编于星期五\17点3.核酸杂交常用方法(1)Southern杂交(Southernblotting)◆也称Southern印迹，由E.M.Southern发明，本质为DNA-DNA杂交，基本过程为：限制酶消化电泳强碱变性转膜杂交洗膜曝光或显色当前第15页\共有58页\编于星期五\17点重物吸水纸膜凝胶塑料膜滤纸缓冲液固相支持物杂交洗膜曝光Southern杂交图解限制酶消化凝胶电泳当前第16页\共有58页\编于星期五\17点植物限制酶消化图谱DNA当前第17页\共有58页\编于星期五\17点Dig标记探针的杂交结果当前第18页\共有58页\编于星期五\17点放射自显影照片当前第19页\共有58页\编于星期五\17点(2)Northern杂交(Northernblotting)◆也称为Northern印迹，本质为利用DNA探针分析RNA样品，基本过程为：分离纯化RNA电泳转膜杂交洗膜曝光或显色变性当前第20页\共有58页\编于星期五\17点在生物芯片(biochip)中采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子有序地固化于支持物表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。此类技术又被统称为微阵列。(3)微阵列(microarray)当前第21页\共有58页\编于星期五\17点DNA微阵列实验流程图：阵列的制作(将确认后的序列自动印制在载玻片或膜上)靶标的制备(样品的提取与标记)杂交扫描检测结果分析DNA微阵列(芯片)的应用：新基因发现、基因诊断、药物筛选、个性化给药当前第22页\共有58页\编于星期五\17点酵母在孢子形成期基因表达分析当前第23页\共有58页\编于星期五\17点(4)原位杂交(insituhybridization)◆在细胞和组织内的原始位置进行杂交检测，靶序列无需分离或纯化。◆包括染色体原位杂交和组织原位杂交两类。◆通常用于定位胞浆内mRNA，分析基因表达。◆基本步骤：组织切片杂交洗涤显微观察当前第24页\共有58页\编于星期五\17点◆染色体原位杂交是在染色体上定位基因或DNA序列：染色体显微片(干燥)除RNA和蛋白质变性DNA洗涤观察分析杂交当前第25页\共有58页\编于星期五\17点4.

核酸分子杂交的应用：核酸杂交遵循碱基配对原则，决定了核酸杂交的特异性；此外核酸杂交可以在DNA与DNA、DNA与RNA及RNA与RNA之间进行，

(1)基因表达检测

(2)从基因组文库或cDNA文库中筛选特定克隆

(3)基因在染色体中的定位

(4)疾病诊断等当前第26页\共有58页\编于星期五\17点二、其它分子杂交技术

1.蛋白质印迹(Westernblotting)◆又称免疫印迹(immunoblotting)，其原理是抗原抗体的特异性结合。◆基本步骤：电泳分离蛋白样品电转膜与一抗反应与二抗反应显色反应当前第27页\共有58页\编于星期五\17点◆二抗可用酶、生物素或荧光物质进行标记。◆ELISA(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)：是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种高度特异性试验分析技术。当前第28页\共有58页\编于星期五\17点2.凝胶滞留法(gelretardationassay)◆又叫迁移率改变法(mobilityshiftassay)，是检测DNA结合蛋白的一种简单灵敏的方法。◆基本原理：蛋白质可与DNA形成复合物，在进行PAGE电泳检测时，这些复合物比游离的DNA慢很多形成一个滞后带。当前第29页\共有58页\编于星期五\17点第二节聚合酶链反应(PCR)Section2PolymeraseChainReaction当前第30页\共有58页\编于星期五\17点一、PCR基本原理◆是在热稳定DNA聚合酶催化下的体外DNA合成的循环反应。◆PCR反应体系：DNA模板、热稳定性DNA聚合酶、引物、四种dNTP和Mg2＋。◆PCR反应三个基本过程：

(1)变性：利用高温(~95℃)使双链解开。

(2)退火：在低温(25~65℃)下使引物与模板配对。

(3)延伸：在~72℃利用热稳定DNA聚合酶催化DNA合成。当前第31页\共有58页\编于星期五\17点模板DNA引物dNTPTaqDNAPol变性退火延伸PCR循环当前第32页\共有58页\编于星期五\17点◆PCR反应三个基本过程可以不断循环，从而使体系内DNA的量呈指数增长。变性退火延伸变性退火延伸循环1循环2经过多轮PCR当前第33页\共有58页\编于星期五\17点二、PCR反应试剂1.模板

(1)模板DNA用量少，一般使用102~105拷贝

(2)有一定的纯度要求

(3)对模板的序列有一定了解2.引物◆引物为一段寡核苷酸序列。◆每条引物的典型浓度约0.1~0.5μmol/L当前第34页\共有58页\编于星期五\17点◆引物设计一般原则：

(1)为待扩增序列两端的已知序列

(2)长度一般为18-30个寡核苷酸

(3)G+C含量合理：40~60%，Tm＝4(G+C)＋2(A+T)(4)在3'末端避免富含G或C(5)避免引物二聚体的形成

(6)避免引物形成发夹结构

(7)在5'端可引入限制位点当前第35页\共有58页\编于星期五\17点3.DNA聚合酶◆热稳定性DNA聚合酶，从嗜热菌可获得。◆聚合酶的选择以实验目的为依据常用热稳定性DNA聚合酶酶最佳温度(℃)外切酶活性保真度Taq75~805'→3'低Tfl70－低Pfu72~783'→5'高DeepVent70~803'→5'高Pwo60~653'→5'高◆聚合酶的浓度通常为2~2.5U/100μl。当前第36页\共有58页\编于星期五\17点4.dNTP◆高浓度的dNTP对扩增反应具有抑制作用，甚至引起聚合酶的错配，一般将浓度控制在200μmol/L左右。5.Mg2＋◆Mg2＋浓度高会引起非特异性产物增加，Mg2＋浓度低，会使聚合酶活性降低，一般控制在0.5~2.5mmol/L当前第37页\共有58页\编于星期五\17点6.pH缓冲体系◆标准PCR体系常使用10mmol/L的Tris-HCl(pH8.3-8.8)

缓冲体系，反应时由于温度升高体系的pH值可回落至7.2左右。7.一价阳离子◆标准PCR体系常使用50mM的KCl，对于扩增500bp

以上的片段有利，调整至70~100mmol/L时，对扩增较短片段有利。当前第38页\共有58页\编于星期五\17点三、PCR循环1.标准PCR循环包括变性、退火和延伸三步：变性：94-96℃退火：55-65℃延伸：~72℃重复25~35次当前第39页\共有58页\编于星期五\17点2.PCR循环效率

◆与聚合酶活力直接相关：

Nf＝N0(1+Y)n

Nf为n次循环后的扩增序列拷贝数

N0为靶序列的起始拷贝数

Y为扩增效率，n为循环数若Y＝100％，则：Nf＝N0·2n

◆

当靶序列拷贝数达1012时，聚合酶成为扩增限制性因素当前第40页\共有58页\编于星期五\17点1.目的基因的克隆2.基因的体外突变3.DNA和RNA的微量分析4.DNA序列测定5.基因突变分析四、PCR的主要应用当前第41页\共有58页\编于星期五\17点五、反转录PCR(ReversetranscriptionPCR，RT-PCR)1.RT-PCR过程以RNA为模板，经逆转录产生cDNA链，并用以进行常规PCR。RNA→cDNA→dsDNA→PCR当前第42页\共有58页\编于星期五\17点正义引物更多PCR循环RNARNARNADNADNADNADNA反义引物当前第43页\共有58页\编于星期五\17点2.RT-PCR的应用(1)定量分析mRNA，测定基因表达强度(2)构建大容量的cDNA文库(3)鉴定已转录序列是否已经发生突变当前第44页\共有58页\编于星期五\17点六、实时定量PCR(realtimePCR)◆使用荧光试剂标记PCR产物，可对模板量(基因拷贝数)和PCR产物进行定量分析，具有很好的可靠性。◆实时定量PCR包括两种：

(1)通过插入荧光染料进行定量，如SYBRGreen(2)利用荧光标记的寡核苷酸探针进行定量，如

TaqMan探针当前第45页\共有58页\编于星期五\17点SYBR与dsDNA结合，在受到激发时，可发出绿色荧光。当前第46页\共有58页\编于星期五\17点当前第47页\共有58页\编于星期五\17点当前第48页\共有58页\编于星期五\17点当前第49页\共有58页\编于星期五\17点第三节DNA测序Section3DNASequencing当前第50页\共有58页\编于星期五\17点一、双脱氧链终止法

(DideoxyChainTerminationMethod)◆双脱氧链终止法由FredSanger(1977)所发明。◆原理：在DNA聚合反应体系中加入ddNTP，使DNA的聚合进程随机终止，通过PAGE分析，直接读出DNA序列。◆双脱氧链终止法反应体系组成：DNA模板(即待测序DNA)、DNA聚合酶、测序引物和dNTP(ddNTP和标记dNTP)。双脱氧链末端终止法(F.Sanger，1977)和化学裂解法(Maxam和Gilbert，1977)。当前第51页\共有58页\编于星期五\17点ddNTPdNTPdNTP与ddNTP的结构当前第52页\共有58页\编于星期五\17